Ⅳ型猪源HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系的建立

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戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)感染引起的病毒性肝炎症,具有急性病毒性肝炎的临床和流行病学特征,其临床症状与甲型肝炎相似。急性戊型肝炎患者一般发病期为3至4周左右,期间除了体内转氨酶水平升高之外,一般不产生明显的并发症。但研究也表明,急性戊型肝炎对孕妇具有威胁。孕妇在妊娠期内,感染急性戊型肝炎的概率要大于其他人群,因其导致的流产率接近20%。免疫力低下的患者感染HEV后能够发展为慢性戊型肝炎。有些慢性戊型肝患者因肝脏快速纤维化而出现肝硬化,并最终导致肝功能衰退甚至肝脏衰竭。现有的研究已发现,戊型肝炎病毒共分为4种基因型,其中Ⅳ型HEV能普遍感染人和牲畜,在卫生条件差或饮水问题严重的地区极易大规模爆发和流行,对社会造成巨大和健康隐患和经济损失。为了对Ⅳ型HEV更好的进行检测和生物学活性研究,本文做了两方面的研究:研究一根据GenBank收录的多株Ⅳ型猪HEV ORF2保守基因序列,设计一对特异性引物,建立起一套Ⅳ型HEV SYBR Green Real-time RT-PCR方法,并对其稳定性,特异性及灵敏度做了相关分析,同时与常规的巢式PCR(或称nested-RT-PCR)进行比较。结果显示,建立的标准曲线相关系数(R2)、组内重复性Ct值变异系数(CV%)和组间重复性Ct值变异系数(CV%)均符合要求,显示该方法具有良好的稳定性。且与传统的巢式PCR相比,本研究所建立的荧光定量PCR方法能更好的运用于对Ⅳ型猪HEV的检测和定量研究。研究二为获得单一的、高纯度的Ⅳ型猪HEV病毒液,本研究将猪戊型肝炎急性期内的Ⅳ型HEV阳性粪便悬液经快速离心和过滤后感染人肝癌细胞(smmc-7721),进行病毒毒株的纯化与扩增,成功的建立起一套稳定的Ⅳ型猪HEV体外细胞培养体系。接种阳性粪便悬液的细胞在接毒后发生大量凋亡并裂解,并发现人肝癌smmc-7721细胞系支持Ⅳ型猪HEV的增值。对不同初始病毒接种量下HEV的增值趋势分析显示,在一定条件和范围内,HEV初始接种量越大,病毒的增值速度越快,增值效率也越高。此外对Ⅳ型猪HEV毒株进行了7次持续的传代培养,细胞上清液中HEV的拷贝量最高可在接毒后第72天增值至2.05×107copies/mL。与传统的HEV体外细胞培养体系相比,本研究根据人肝癌smmc-7721细胞所建立的体外培养体系能更好的应用于对Ⅳ型猪HEV进行大量的、持续的培养。通过本研究,初步构建起一套较为稳定的Ⅳ型猪HEV荧光定量PCR检测及其体外细胞培养体系,能在检测对Ⅳ型猪HEV进行检测的同时,对HEV在smmc-7721细胞中的增值进行较为准确的定量。本研究对戊型肝炎的检测与防治具有积极的意义,也利于对在分子水平对HEV展开进一步的研究。
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