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研究背景和目的 目前认为,在急性缺血性肾衰竭(iARF)发病过程中,许多炎症因子如: 内皮素-1(ET-1)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS )、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1) 、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等参与了肾损害的发生。这些炎性介质基因都含有(B位点,它们的产生受到转录因子NF-κB的调控。体内外转染将NF-κB结合位点寡聚核苷酸序列(NF-κB decoy ODN)技术可以特异性地抑制其活性,这一策略已经应用在某些疾病的治疗研究中,并且显示出了广阔的前景。但究竟对体外培养的肾小管上皮细胞的作用如何,目前尚无报道。本研究旨在建立高效、稳定的鱼精蛋白-脂质体(protamine liposome,PL)转染技术的基础上,观察NF-κB诱捕物ODN对肾小管上皮细胞的NF-κB活性及下游炎症分子表达的影响。方法选用NRK-52E肾小管上皮细胞株经TNF(体外 刺激培养。实验分三部分:建立鱼精蛋白-脂质体转染NF-κB诱捕物ODN的技术(protamine liposome,PL法):将NF-κB 诱捕物 ODN与鱼精蛋白、脂质体混合,转染至TNF( 刺激的含完全血清培养的大鼠肾小管上皮细胞内,测定转染效率。用凝胶电泳迟滞分析(EMSA)测定转染NF-κB 诱捕物ODN后细胞NF-κB活性。用RT-PCR方法检测转染NF-κB 诱捕物 ODN后细胞中的ET-1、iNOS、ICAM-1、VCAM-1以及MCP-1 mRNA表达水平。结果ODN的细胞摄入率及分布:经PL法转染的NRK-52E细胞,2 h 后胞核内可见较强荧光颗粒分布。而裸转染ODN,胞核一直无明显荧光分布。经FCM分析,经PL法转染2 h 后的转染率为93.20%,而裸转染率仅为为39.03%。经TNF(刺激30 min后,NRK-52E细胞的NF-κB活性开始升高,并且随着刺激<WP=5>时间的延长而不断上升,在刺激6 h后活性达高峰,于刺激12 h后开始回落。在转染NF-κB 诱捕物ODN 6 h后,该组细胞的NF-κB活性被抑制。经TNF-(刺激培养的NRK-52E细胞, ET-1、iNOS、ICAM-1、, VCAM-1以及MCP-1 mRNA的表达明显增加,与无TNF-(刺激培养组比较,差异有显著性,P (0.01;经转染NF-κB诱捕物ODN后,这些分子的mRNA表达被明显抑制,与TNF-(刺激培养组比较,P (0.01。 结论PL法是一项高效的阳离子转染技术,克服了大多数阳离子脂质体不能够应用于含血清条件下转染的限制。可以成功地将NF-κB结合位点诱捕物 ODN转染至体外培养的肾小管上皮细胞中,对此方法进行进一步的研究,将具备广阔的应用前景。在体外培养的NRK-52E肾小管上皮细胞株中,NF-κB诱捕物 ODN可以特异性地抑制被TNFα激活的NF-κB,而错配的scrambled ODN则无此作用,所以NF-κB诱捕物ODN策略可以作为研究NF-κB作用的特异性手段。活化的NF-κB可以上调 ET-1、iNOS 、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1等炎症因子的表达,当NF-κB被NF-κB诱捕物 ODN抑制后,这些因子的表达也被相应地抑制。因此, NF-κB诱捕物ODN的策略可以通过阻止NF-κB活性,进而抑制多种被调控的炎症因子表达。进一步研究NF-κB诱捕物 ODN对肾小管上皮细胞的保护作用,可望将此策略作为包括缺血性ARF在内的多种疾病治疗的新手段。