大量氯氟烃类(Chlorofluorocarbons,CFCs)气体由于人类的工业活动被释放到空气中,致使大气臭氧层变薄,从而引起太阳辐射中到达地面的中波紫外线(Ultraviolet-B,UV-B,280-320nm)辐射增强,UV-B辐射增强对陆生植物个体、种群及生态系统都产生了较为明显的影响。花生(Arachis hypogaea L.)为豆科落花生属一年生草本植物,富含脂肪和蛋白质,为主要食用植物油来源,目前,有关UV-B辐射增强对花生的生理生态影响报道较少,其影响的分子机制也鲜有探索。本研究以“小京生”花生为试验材料,分析UV-B辐射增强对其幼苗形态、气体交换参数、叶绿体超微结构、活性氧水平、抗氧化酶活性和抗氧化剂含量等的影响；并通过蛋白质组学方法研究UV-B辐射增强对花生蛋白表达的影响；在此基础上,克隆受UV-B辐射增强影响表达下调的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA)基因AhFBA,明确其生物信息学特征及受UV-B影响的转录情况；将AhFBA基因导入大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,观察宿主菌在UV-B增强处理下的生长情况,旨在回答以下几个问题：(1)UV-B辐射增强如何在生理生态水平对花生造成影响?(2)花生在蛋白质水平如何响应UV-B辐射增强处理?(3)FBA蛋白在抵御UV-B辐射增强中是否有作用?研究结果如下：在补增在强度为54μW/cm2的UV-B辐射处理3d后(每天处理8h),花生叶绿素a和叶绿素(a+b)含量均显著下降(P<0.05),同时,气体交换参数也受到显著影响(P<0.05),表现出净光合速率(Pn)降低了35.42%,气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和气孔限制值(Ls)分别下降了28.12%、26.37%和20.25%,然而,胞间CO2浓度(Ci)上升了16.22%,较对照有显著性差异(P<0.05),表明非气孔限制因素是Pn下降的主要原因。同样,荧光参数Fv/Fm和Fv/Fo均显著降低(P<0.05)。但UV-B处理1d和2d后,以上各指标的变化与对照差异不显著(P>0.05)。透射电子显微镜(TEM)图像显示,处理3d的花生叶片叶绿体膜肿胀、基质类囊体解体,光同化产物淀粉粒数目和大小减少。补增UV-B辐射处理下,花生叶片相对电导率、超氧阴离子(O2·-)、类黄酮和可溶性蛋白质的含量,以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性较对照显著升高(P<0.05)；超氧化物歧化酶(SOD)活性先显著升高后降低；过氧化氢(H202)、丙二醛(MDA)、抗坏血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量,以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性没有显著变化(P>0.05)。可见增强的UV-B能显著提高花生叶片内的活性氧(ROS),而且O2·-是对花生产生氧化胁迫的主要因素,花生幼苗主要通过提高类黄酮含量以及SOD、CAT和POD活性来抵制ROS的胁迫,AsA-GSH循环系统在花生清除ROS中效果不明显。补增UV-B辐射处理下,花生叶片中共检测到丰度变化在2.5倍以上差异表达蛋白点39个(其中22个蛋白质表达上调,17个表达下调),经过MALD1-TOF-TOF分析及数据库检索,成功鉴定出其中的27个蛋白质。被鉴定的27个蛋白质按其功能大致可归为八大类,第Ⅰ类：光合作用相关的蛋白,包括质体蓝素(plastocyanin,PC)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基、放氧复合物增强子蛋白1、PsbP结构域蛋白6；第Ⅱ类：糖代谢相关蛋白,包括苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)和FBA；第Ⅲ类：能量合成相关蛋白,包括ATP合酶；第Ⅳ类：氨基酸代谢相关蛋白,包括半胱氨酸合成酶；第Ⅴ类：蛋白质加工相关蛋白,包括热激蛋白(heat shock protein, HSP);第Ⅵ类：蛋白质翻译相关蛋白,包括核糖体循环因子(ribosome recycling factor, RRF);第Ⅶ类：防御相关蛋白,包括几丁质酶、过氧化物酶、Cu-Zn超氧化物歧化酶、二羟肉桂酸3-O-转甲基酶(caffeic acid3-O-methyltransferase, COMT),类萌发素蛋白(Germin-like protein, GLPs)和病程相关蛋白(pathogenesis-related protein, PR);第Ⅷ类,未知功能蛋白。表明增强的UV-B辐射可能会通过下调PsbP和RRF的表达破坏花生叶绿体类囊体结构、下调PC表达降低光合电子传递速率、下调Rubisco和光合放氧增强蛋白的表达降低光合速率、下调MDH和FBA的量降低糖代谢速率和下调ATP合酶降低能量产生速率等方式影响花生的生理代谢水平；同时,花生也可能通过上调HSP促进新生蛋白质的折叠,包装及跨膜运输、上调COMT促进木质素的合成、上调GLP表达令细胞壁更为致密,抵抗病毒、细菌感染或采食天敌的侵袭、上调PR表达抵御真菌侵染和上调半胱氨酸合成酶促进GSH的合成,维持细胞内的还原态。以大豆(Glycine max)果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因(GmFBA,GenBank登录号：AY492006.1)作为查询探针,在NCBI网站花生EST数据库中进行BLAST检索,选取与之高同源的花生EST序列,通过EST序列拼接获得一条重叠群(contig),再以拼接后的contig作为新的查询探针,继续搜索花生EST数据库,直至无新的EST序列拼接为止。以最终拼接的contig作为花生的FBA基因,并以该序列为模板设计上下游引物。提取花生总mRNA,后转录得cDNA。以cDNA为模板,加入上下游引物,在55℃退火条件下,PCR扩增得到花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基囚,长度为1077bp,命名为AhFBA,(?)该序列提交NCBI网站,GenBank登录号为KF470788。AhFBA基因编码蛋白分子式为C1706H2725N469O524S6,由358个氨基酸组成,所含氨基酸组成以Ala最多,酸性氨基酸(Asp和Glu)和碱性氨基酸(Lys和Arg)个数均为40,相对分子质量分别为38.38kD,等电点分别为6.73,不稳定指数分别为30.03,属于稳定蛋白质,无信号肽序列。AhFBA蛋白定位于细胞质中的可能性最大,分值为0.65,定位于线粒体基质、叶绿体内囊体膜的分值均为0.1,而定位于内质网的分值为O。AhFBA蛋白中有2个酰胺化位点(36和285位),1个cAMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点(41位),3个蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(114、270和309位),7个蛋白激酶C磷酸化位点(50、201、235、247、304、309和336位),7个N-豆蔻酰化位点(25、97、127、137、232、335和346位),1个醛缩酶活性中心(217-227位,序列为VLLEGTLLKPN),AhFBA属于Ⅰ型细胞质FBA基因。AhFBA蛋白与同属豆科的豌豆、鹰嘴豆、蒺藜苜蓿、菜豆和花生的同源性很高。实时荧光定量PCR结果显示,在自然光照生长条件下,AhFBA基因在根、叶、花和幼果中均有表达,且表达量无显著差异(P>0.05)。但是在受到UV-B辐射增强处理后,该基因的表达发生了变化,照射4h后,AhFBA基因在叶中表达上调了10倍以上,接着表达量开始下调,照射8h、16h和24h后,表达量下调了0.75、0.86和0.29倍。表明AhFBA基因属于UV-B诱导型基因,该基因参与了对UV-B胁迫的应答。根据PCR获得的AhFBA序列设计引物(上下游引物分别引入BamHⅠ和HindⅢ酶位点)扩增其编码区序列,用BamH1和Hind Ⅲ分别双酶切花生AhFBA基因和原核表达载体pET28a,双酶切产物通过胶回收试剂盒进行纯化,连接两种胶回收产物,菌液PCR验证和测序结果表明已经成功构建含有目的基因的重组表达载体pET28a-AhFBA。采用热激法将重组表达载体转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)感受态细胞,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发现在40kD附近出现一条明显的蛋白条带,表明目的蛋白AhFBA诱导表达成功。IPTG诱导宿主菌2h后开始接受一定时间的UV-B照射,照射后的菌液接种到新的LB培养基中(含卡那霉素),每隔1h测定一次OD600值,绘制12h内的生长曲线。结果显示,转化pET28a-AhFBA和pET28a的宿主菌BL21(DE3)在接受UV-B照射3min后与对照(转化pET28a的宿主菌BL21(DE3)未照射UV-B)的生长并无明显差别,可见短时间的UV-B照射并未对宿主菌的生长产生不利影响,同时,外源蛋白AhFBA的表达也并未影响到BL21(DE3)的生长；而接受9minUV-B照射后,转化pET28a-AhFBA和pET28a的宿主菌BL21(DE3)生长速率均低于对照,但前者却高于后者,表明外源重组蛋白AhFBA可能有助于宿主菌减轻UV-B照射的不利影响。当UV-B照射12mmin后,转化pET28a-AhFBA和pET28a的宿主菌BL21(DE3)生长速率均低于对照,且两者之间没有差别,表明外源重组蛋白AhFBA能在一定照射时间范围内缓解UV-B辐射对BL21(DE3)的伤害。