【摘 要】
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目的构建17种腹泻相关病毒的重组质粒并制备相应的DNA或RNA标准品,建立可同时筛查17种腹泻病毒的多重Real-time PCR组合检测技术,实现腹泻突发疫情中腹泻相关病毒的快速检测。方法1.应用Primer Express3.0生物学软件设计和评估17种腹泻相关病毒的引物及探针。2.基于基因克隆技术原理制备重组质粒,采用PCR获得病毒目的片段并与T-easy载体连接,再转化导入宿主细胞复制扩增
【基金项目】
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十三五科技重大专项（项目号:2018ZX10711-001）“病毒感染高通量快速检测与应急筛查技术研究”课题；
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目的构建17种腹泻相关病毒的重组质粒并制备相应的DNA或RNA标准品,建立可同时筛查17种腹泻病毒的多重Real-time PCR组合检测技术,实现腹泻突发疫情中腹泻相关病毒的快速检测。方法1.应用Primer Express3.0生物学软件设计和评估17种腹泻相关病毒的引物及探针。2.基于基因克隆技术原理制备重组质粒,采用PCR获得病毒目的片段并与T-easy载体连接,再转化导入宿主细胞复制扩增重组质粒。3.通过PCR或体外转录制备17种腹泻相关病毒的DNA或RNA标准品。4.分别优化17种病毒的单重/多重Real-time PCR方法的反应体系和反应条件,评价所建立方法的灵敏性（最低检出限）、特异性（交叉反应）和稳定性（组内、组间重复）。5.收集2020年9～11月重庆某医院5岁以下儿童粪便腹泻样本对所建立的方法进行应用评价。结果1.成功获得了作为实验室评价参考品的17种病毒的重组质粒和标准品。2.17种病毒单重检测的最低检出限可达到100～103copies/μL,组间无明显交叉反应,批内变异系数小于3%,批间变异系数小于4%。3.建立了同时检测17种腹泻病毒的6组多重实时荧光定量PCR方法,最低检出限可达到100～103copies/μL,与单重反应相比无明显差异,组内组间无明显交叉反应,批内、批间变异系数均小于5%。4.利用上述方法对2020年重庆某医院100例儿童腹泻样本进行了检测,79例患儿样本检测阳性,包括5例诺如病毒GI型、52例诺如病毒GII型,6例肠道腺病毒,14例星状病毒,6例札如病毒,5例A组轮状病毒,1例诺如病毒GIV型,其中7例混合阳性。结论成功构建17种腹泻相关病毒的重组质粒并制备相应的DNA或RNA标准品。本研究建立的17种腹泻相关病毒的单重和多重Real-time PCR检测方法的灵敏度高、特异性强和稳定性好,可以在实验室推广应用。本研究为腹泻多病原的快速检测提供了技术储备,也为进一步建立能实现更多病原更少组合的检测方法奠定了基础。图22幅;表36个;参考文献185篇。
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