癌痛是长期困扰肿瘤病人的问题之一,不仅影响病人的情绪和生活质量,而且可能成为病人及家属决定停止积极治疗的一个重要因素。因而研究癌痛的机制,解决癌痛之苦成为临床上的迫切需要。临床最常见的三大肿瘤为肺癌、乳腺癌、前列腺癌,此类肿瘤晚期很容易发生骨转移,而骨癌痛则是慢性癌痛最为常见的一种,因此从研究骨癌痛的发生发展机制入手揭开癌症痛的机制有重要的临床意义。由于缺乏合适的研究模型,癌痛的研究进展远远落后于炎症痛和神经病理性疼痛。近年来先后出现了一批成功的骨癌痛模型,模型制作多采用骨髓腔内直接接种肿瘤细胞的方法。骨癌痛模型将肿瘤局限在骨髓腔内,从而最大程度地减少了肿瘤广泛的系统性影响。在这些骨癌痛动物模型上可以观察到许多与临床症状类似的疼痛行为学表现,如自发性疼痛、痛觉过敏等。这些模型的出现大大加速了癌痛机制研究的进程,为寻找有效的癌痛治疗手段提供了良好的契机,骨保护素等在模型上已被证明能有效抑制癌痛。目前研究认为,骨癌痛是一种机制独特而复杂的慢性疼痛,尽管癌痛含有炎症痛以及神经病理性痛的成分,但是癌痛决不是炎症疼痛以及神经病理性疼痛的简单总和。因此,有必要深入研究癌痛机制并探索有效的癌痛治疗方法。而电压门控性钠通道被认为在疼痛通路中起重要的作用,钠通道各亚型的运输,分布和密度,以及通道本身内在特性在相当程度上影响了外周感觉神经元的兴奋性,而伤害性感受神经元的电活动促成了疼痛的产生。河豚毒素不敏感(TTX-R)的Nav1.8钠通道专一表达在外周感觉神经元上,产生慢失活TTX-R钠电流,此通道是其所在细胞动作电位去极化期的钠电流的主要通道,被认为在伤害性感受器外周致敏中发挥了重要作用,因此Nav1.8在疼痛通路特别是在外周敏化的作用是疼痛机制研究的热点。Nav1.8在炎症痛模型DRG神经元上表达上调,TTX-R钠电流明显增加。此外,Nav1.8也参与了神经病理性疼痛的维持。鞘内注射反义寡核苷酸选择性降低Nav1.8表达,可有效的阻止由慢性神经或组织损伤引起的痛觉过敏和异常性疼痛。遗传学的方法技术则更有力的支持了Nav1.8在疼痛通路中不可或缺的作用,Nav1.8基因缺失小鼠对伤害性机械性刺激表现出明显的痛觉缺失,炎症性痛觉过敏延迟发展。目前癌痛模型上电压门控性钠通道表达调节的相关研究还罕见报道。本研究着眼于电压门控性钠通道Nav1.8在骨癌痛外周敏化机制中的作用,通过Walker 256乳腺癌肉瘤细胞建立大鼠胫骨骨癌痛模型,从不同层面探索Nav1.8参与的骨癌痛维持机制。研究内容主要包括以下四个方面:⑴大鼠胫骨内注射walker256乳腺癌细胞建立骨癌痛模型及进行疼痛行为学评估;⑵通过REAL-TIME PCR、免疫印迹和免疫荧光染色观察DRG神经元中Nav1.8钠通道mRNA和蛋白表达情况;⑶利用全细胞膜片钳技术记录DRG神经元TTX-R钠电流,观察TTX-R钠通道的功能变化;⑷鞘内给予Nav1.8反义寡核苷酸对骨癌痛大鼠疼痛行为的影响。通过以上实验探讨钠通道Nav1.8是否和如何参与了骨癌痛维持过程中的痛觉过敏。结果如下:1.骨癌痛模型建立雌性Wistar大鼠胫骨内接种2×105个Walker 256细胞,术后第10天起观察到自发性运动痛评分进展性增高;诱发痛行为主要表现为机械性痛觉过敏而无明显的热痛觉过敏,与文献报道一致。在骨癌晚期(术后第17天起)可以观察到镜像痛行为。影像学结果提示,术后第21天骨质破坏明显,部分大鼠出现病理性骨折。病理检查可见晚期胫骨外观呈膨胀性增生,胫骨内有肿瘤生长,骨质破坏和增生同时存在。脊髓切片GFAP染色见患侧全层星形胶质细胞明显肥大增生。以上结果表明大鼠骨癌痛模型成功建立,模型主要行为学特征为自发性运动疼痛机械性痛觉过敏和机械性痛觉过敏。2. Nav1.8钠通道在骨癌痛大鼠DRG神经元中的表达下调骨癌痛大鼠在术后16-19天疼痛行为明确且稳定。在此期间,骨癌痛大鼠双侧腰段DRG神经元中Nav1.8 mRNA水平显著降低。Western blot结果显示,骨癌痛大鼠双侧DRG中Nav1.8蛋白水平明显降低,术侧蛋白表达比对侧更低。免疫荧光染色发现,癌痛大鼠双侧DRG神经元Nav1.8免疫荧光强度均有所降低,Nav1.8在小细胞上的表达显著减少。以上结果提示在骨癌痛大鼠疼痛维持期,Nav1.8在DRG神经元表达的显著降低可能与癌痛相关。骨癌痛大鼠手术对侧DRG神经元Nav1.8的变化提示骨癌痛发展维持过程中肿瘤源性的因素对钠通道表达的调节作用。3.骨癌痛大鼠DRG神经元TTX-R钠电流密度下降骨癌痛组DRG神经元的形态及被动膜电生理特性包括膜电容、静息电位等与对照组相比均无显著差异。癌痛组术侧DRG神经元总钠电流和TTX-R钠电流密度大量降低,提示Nav1.8的表达降低引起了TTX-R钠电流的减少。而骨癌痛对侧钠电流与假手术组相比无明显变化,提示肿瘤引起钠通道亚型的可塑性变化和功能代偿。4.鞘内给予Nav1.8反义寡核苷酸可有效减轻骨癌痛大鼠疼痛行为鞘内注射Nav1.8反义寡核苷酸可显著降低癌痛大鼠的自发性运动痛和机械性痛觉过敏。免疫荧光染色结果显示,鞘内注射Nav1.8反义寡核苷酸可以显著降低大鼠双侧DRG神经元上Nav1.8的表达。提示鞘内注射Nav1.8反义寡核苷酸效果可靠,通过干扰Nav1.8基因转录进而减少Nav1.8的表达减轻了骨癌痛大鼠的疼痛行为。根据以上结果可以得出如下结论:1.胫骨内接种Walker 256乳腺癌肉瘤细胞可以成功构建大鼠胫骨骨癌痛模型,其行为学特征主要表现为自发性疼痛和机械性痛觉过敏。2.Nav1.8钠通道参与了骨癌痛大鼠疼痛维持机制。(1)骨癌痛大鼠的疼痛维持与其脊髓背根神经节中Nav1.8钠通道在小细胞上的分布显著减低有关,而后者可能与Nav1.8 mRNA水平降低有密切关系。(2)骨癌痛大鼠DRG神经元上总钠电流和TTX-R钠电流密度大量降低,Nav1.8钠通道的表达下调引起了TTX-R钠电流密度的下降。(3)反义寡核苷酸法特异性敲低Nav1.8钠通道的表达,可以显著减轻骨癌痛大鼠的疼痛行为。(4)骨癌痛大鼠对侧DRG神经元上Nav1.8钠通道表达及钠电流的特征提示肿瘤源性因素可能参与了钠通道亚型表达的调控。