研究背景及目的:NK/T细胞淋巴瘤(NK/T cell lymphoma,NKTL)在世界范围内的发生,具有明显的地理特征,主要发生在亚洲以及中南美洲,在这些地区中占淋巴瘤发生率的5%~15%,欧洲和北美也有相关病例报道。NKTL是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)的一种高度侵袭性亚型,其病程进展快,患者生存期短,预后较差。大约三分之二的NKTL病例都局限于I期和II期,主要发生在上呼吸消化道(upper aerodigestive tract,UADT)。先前NKTL的治疗方案通常采用同时或序贯的化疗与局部放疗相结合,总体反应率为80~90%,五年无进展生存期(progression-free survival,PFS)和总生存期(overall survival,OS)分别为60~85%和64~89%,但在过去的20年中,由于NKTL中P-糖蛋白的高表达,患者对先前化疗方案中采用的阿霉素和环磷酰胺发生内在抗性,因此近年来NKTL的治疗已发生较大变化。与此同时,有研究表明NKTL细胞由于缺乏天冬酰胺合成酶的表达从而对含有α-天冬酰胺酶的化疗方案敏感,即便如此,患者对L-天冬酰胺酶完全反应率仍仅为50~60%,五年OS约为50%,并且NKTL患者接受含L-天冬酰胺酶的化疗方案后易复发,且复发后的OS仅有几个月,可见含L-天冬酰胺酶的化疗方案对于NKTL的治疗仍不容乐观。NKTL患者对SMILE方案(左旋门冬酰胺酶+甲氨蝶呤+依托泊苷+地塞米松+异环磷酰胺)和MPVIC-P(甲氨蝶呤+培洛霉素+依托泊苷+异环磷酰胺+卡铂)方案有较好的临床反应。然而,以上这些化疗或者放疗常伴有严重的不良反应,包括严重感染导致的死亡以及放射治疗引起的大脑损伤。因此,急需一种新的化疗方案出现以减轻患者这些严重的副作用。由于国际上对NKTL的标准化疗没有达成共识,本中心开发出一种新的化疗方案DDGP(顺铂+地塞米松+吉西他滨+培门冬酶),此方案已得到国内业界的认可。在最新的临床试验统计中(NCT01501149),与采用SMILE方案的初治晚期患者相比,采用DDGP方案化疗的80例NKTL患者具有更长的PFS、OS以及更好的耐受性。因此,该化疗方案已成为本中心治疗NKTL的一线化疗方案。尽管如此,仍有一部分患者对以吉西他滨为主的化疗方案不敏感:新诊断的III/IV期患者的完全反应率(complete remission rate,CRR)为60.7%,而复发或难治性患者的CRR仅为53.1%,究其原因,可能与患者本身对吉西他滨耐药或者在化疗过程中产生耐药有关。核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase,RNR)是DNA合成的限速酶,专门催化核糖核苷酸转化为DNA合成和修复所必需的2-脱氧核糖核苷酸。RNR包含两个同源二聚体,每个二聚体由两个亚基组成:大的调节亚基(ribonucleotide reductase subunit M1,RRM1)和一个小的催化亚基RRM2。吉西他滨可与核糖核苷酸还原酶不可逆转地结合并使其大亚基失活,因此RRM1是决定吉西他滨疗效的关键分子。迄今为止,体内体外实验已多次报导在不同的肿瘤病人中RRM1高表达与吉西他滨耐药有关,并且RRM1表达的下调可能增加耐药细胞对吉西他滨的敏感性,但RRM1在NK/T细胞淋巴瘤中的研究较少,其作用及机制更是鲜有报道,NKTL中RRM1与吉西他滨敏感性关系及机制有待实验证明。前期,我们对NKTL细胞株及其吉西他滨耐药株进行蛋白质组学测序发现,RRM1在NKTL吉西他滨耐药细胞中高表达。为了探讨RRM1在吉西他滨耐药的NKTL中的作用机制,首先我们通过免疫组化、荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)以及Western blot检测RRM1在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织以及细胞株中的表达,分析RRM1的表达与NKTL各临床因素和预后的相关性,初步了解RRM1在NKTL的表达情况;随后,通过慢病毒转染应用RRM1高表达质粒使NKTL细胞过表达RRM1,以及应用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)使耐药细胞的RRM1沉默表达,采用CCK-8和流式细胞术检测细胞对吉西他滨作用的敏感性和凋亡情况,运用转录组测序以及Western blot检测RRM1上调和下调所引起的下游蛋白及信号通路变化,揭示出RRM1介导的吉西他滨耐药在NK/T中的生物学作用及机制;最后,通过我们独有的建模方法构建NK/T小鼠皮下移植瘤模型,运用小动物生物发光成像观察吉西他滨作用后RRM1过表达对吉西他滨的敏感性,并通过免疫组化的方法鉴定RRM1下游RAS激活样蛋白3(RAS protein activator like-3,RASAL3)及其调节的信号通路的变化,对其相关机制作进一步探讨和验证。本研究结果将为确定RRM1与吉西他滨耐药关系方面提供重要的证据,并为RASAL3蛋白或者细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)通路作为逆转吉西他滨耐药的靶点提供依据,为在临床上对吉西他滨耐药的NKTL患者的治疗提供另一种可能。第一部分RRM1在NK/T细胞淋巴瘤中的表达及临床意义方法(1)收集62例吉西他滨治疗的NK/T细胞淋巴瘤患者肿瘤组织标本,应用免疫组化方法检测RRM1在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织中的表达。(2)采集62例患者的临床数据,Pearsonχ2检验用来检测RRM1与临床特征、生化指标及分期的相关性。(3)应用Kaplan–Meier生存曲线分析RRM1的表达与NK/T细胞淋巴瘤患者OS和PFS之间的相关性;应用Cox比例风险回归模型确定OS和PFS的预后因子。(4)应用荧光定量RCR以及Western blot的方法检测B淋巴瘤细胞株(LY8、Raji)、T淋巴瘤细胞株(Hut78、Karpas、Jurkat)、NKTL细胞株(YT、NKYS)以及正常NK细胞中RRM1的表达。结果(1)在NKTL肿瘤组织中,RRM1胞浆着色,62(100%)例患者均存在RRM1的表达,其中29例(46.8%)患者高表达,33例(53.2%)患者低表达。RRM1高表达和RRM1低表达组患者在在性别、年龄、Ki67、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、EB病毒DNA(Epstein-Barr virus DNA,EBV-DNA)拷贝数方面及分期均没有明显差异。在33例RRM1低表达的患者中,吉西他滨治疗的有效率为71.9%(23例/33例),而在29例RRM1高表达的患者中,吉西他滨治疗的有效率为31.0%(9例/29例),两组患者的化疗有效率差异有统计学意义(P=0.002)。(2)与RRM1低表达组NKTL患者相比,RRM1高表达组患者的PFS(P=0.000)与OS(P=0.002)明显缩短,且差异具有统计学意义。(3)与正常NK细胞、B淋巴瘤细胞株(LY8、Raji)和T淋巴瘤细胞株(Hut78、Karpas、Jurkat)相比,RRM1在NKTL细胞株YT(P=0.0003)和NKYS(P=0.0005)中的RRM1在mRNA和蛋白表达水平均较低。小结(1)RRM1的表达与NKTL患者吉西他滨化疗的疗效相关,与性别、年龄、Ki67、LDH、EBV-DNA拷贝数、IPI评分及分期均不相关。(2)RRM1在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤组织中有高表达与低表达之分,低表达患者对以吉西他滨为主的化疗方案效果较好。(3)RRM1在NKTL细胞中(YT和NKYS)中低表达。第二部分RRM1对吉西他滨耐药的NK/T细胞淋巴瘤的作用机制方法(1)Western blot检测RRM1蛋白在吉西他滨敏感细胞株(YT)以及吉西他滨耐药细胞株(YT-R)细胞中的表达。(2)利用慢病毒转染的方法使用RRM1质粒在YT细胞中过表达RRM1,构建YT-RRM1细胞;使用shRNA在YT-R细胞中沉默RRM1,构建YT-R-shRRM1细胞。(3)CCK8分别检测并比较吉西他滨作用于YT、YT-RRM1、YT-R和YT-R-shRRM1细胞后的IC50值的变化。(4)流式细胞术分别检测并比较吉西他滨作用于YT、YT-RRM1、YT-R和YT-R-shRRM1细胞凋亡率的影响。(5)转录组学测序比较YT和YT-RRM1基因表达的差异。(6)Western blot的方法比较YT和YT-RRM1细胞、YT-R和YT-R-shRRM1细胞中RRM1下游蛋白的变化。结果(1)与YT细胞相比,YT-R细胞中RRM1的表达明显升高(P<0.001)。(2)吉西他滨作用YT细胞的IC50值为0.009μg/ml,而吉西他滨作用YT-RRM1细胞的IC50值为43μg/ml;采用0.009μg/ml吉西他滨作用于YT和YT-RRM1细胞48h后,细胞凋亡比例分别为49.2%和7.37%(P<0.01)。(3)转录组学测序显示:与YT细胞相比,YT-RRM1共有42个基因上调,154个基因下调,其中与耐药相关的ERK信号通路中的关键基因RASAL3下调。与YT细胞相比,YT-RRM1细胞的RASAL3蛋白表达下调,p-ERK蛋白表达上调。(4)吉西他滨作用于YT-R细胞的IC50为36μg/ml,而吉西他滨作用于YT-R-shRRM1细胞的IC50为0.003μg/ml;应用0.003μg/ml的吉西他滨作用后,YT-R和YT-R-shRRM1细胞凋亡比例分别为2.63%和46.0%(p<0.001)。(5)与YT-R相比,YT-R-shRRM1细胞的RASAL3表达上调,p-ERK表达下调。小结(1)与正常的YT细胞株相比,吉西他滨耐药细胞中RRM1的表达明显升高。(2)正常的YT细胞株转染RRM1后对吉西他滨的敏感性下降,且不受吉西他滨凋亡诱导作用的影响;吉西他滨耐药细胞进行RRM1沉默后对吉西他滨的敏感性增加,且吉西他滨作用后其凋亡明显增加。(3)RRM1可下调RASAL3的表达,从而使ERK通路活化增加,导致NKTL对吉西他滨耐药。第三部分RRM1对吉西他滨耐药的NK/T细胞淋巴瘤作用机制的体内验证方法(1)使用NOD/SCID小鼠和YT、YT-RRM1细胞构建NKTL小鼠皮下移植瘤模型。待肿瘤平均直径达到0.5cm左右时,在每组中随机取3只小鼠的肿瘤组织进行HE染色以及免疫组化指标(CD56、Proferin、EBER、RRM1、RASAL3、pERK)检测,根据免疫组化评分方法比较YT和YT-RRM1两组肿瘤组织中的CD56、Proferin、EBER、RRM1、RASAL3以及p-ERK的表达。(2)对剩余小鼠进行干预分组,即YT空白对照组、YT吉西他滨组、YT-RRM1空白对照组和YT-RRM1吉西他滨组,保证每组实验小鼠6只。接种后第9天吉西他滨腹腔注射给药,每周两次,每日观察各组荷瘤小鼠的生长情况,给药前及给药期间每3天测量肿瘤长径与短径大小,规律进行小动物成像以记录各组小鼠给药期间肿瘤的生物发光信号强弱,比较吉西他滨对YT和YT-RRM1小鼠治疗前后肿瘤体积的变化。结果(1)运用YT和YT-RRM1细胞构建NKTL动物模型成瘤率100%,免疫组化提示NK/T细胞标记CD56、细胞毒性颗粒相关标记Proferin以及EBER在各组瘤组织中呈不同程度的表达,且各指标在各组肿瘤组织中的表达无明显差别,证明模型制备成功。(2)免疫组化结果显示:与YT小鼠模型相比,YT-RRM1小鼠模型组织中的RRM1及p-ERK的表达均升高,RASAL3的表达下降。(3)YT空白对照组小鼠在干预后第24天开始逐渐死亡,YT-RRM1空白对照组小鼠在干预后第21天开始逐渐死亡,YT-RRM1吉西他滨组小鼠在干预后第33天开始逐渐死亡,截止第80天YT吉西他滨组未有死亡。(4)在YT小鼠模型中,与空白对照组相比,吉西他滨治疗组肿瘤体积逐渐减小直至消失,肿瘤生物发光信号逐渐减弱直至消失(P<0.01);在YT-RRM1小鼠模型中,吉西他滨治疗组与空白对照组肿瘤体积大小变化无明显差异,肿瘤生物发光信号变化无明显差异。小结(1)体内实验表明吉西他滨能够抑制YT小鼠模型的肿瘤生长,但对RRM1高表达的YT小鼠模型无肿瘤抑制作用。(2)肿瘤组织免疫组化结果提示RRM1通过下调RASAL3的表达使ERK通路活化增加,从而导致NKTL对吉西他滨的耐药。全文结论1.RRM1在NK/T细胞淋巴瘤肿瘤中有高表达与低表达之分,低表达患者对吉西他滨化疗效果较好。2.RRM1的表达与NK/T淋巴瘤对吉西他滨的敏感性呈负相关。3.RRM1可下调RASAL3的表达使ERK通路活化增加,导致NKTL对吉西他滨耐药。4.吉西他滨抑制正常NKTL小鼠模型的肿瘤生长,对RRM1高表达的NKTL小鼠模型的肿瘤生长无抑制作用。