伴随自然生态环境恶化和人员频繁交流,新发和再发传染病不断威胁人类与动物的健康,及时发现鉴定病原体是有效控制传染病疫情的关键。野生动物是多种病原体的重要自然宿主,特定情况下可通过直接或间接接触,将病原体传播给人类与其他动物,导致疫情传播扩散。我国黑龙江省与云南省自然资源丰富,同一生态环境中生存着大量野生动物,为病原体在不同动物物种间传播提供了有利条件。本研究针对黑龙江省与云南省小型野生宿主动物的病原体种类及分布进行调查和分析,以发现并分离潜在病原体,掌握其遗传进化规律,为快速应对未来可能的相关突发公共卫生事件提供参考。本研究选取我国黑龙江省饶河县、云南省瑞丽市、云南省景洪市作为采样地点,综合使用铗捕法、笼捕法、陷阱法等方法,采集当地小型野生动物,解剖获取心、肝、肾、肺、脑等组织。组织样本依照动物种类、性别、年龄、数量等信息进行分组后,使用Tri Zol法提取核酸,构建文库,进行病毒宏基因组测序。去除宿主信息后,利用生物信息学方法,进行物种注释和丰度分析,绘制热图、主成分分析图、物种累计曲线箱线图、随机森林图等,比较不同地区不同动物物种间的病原体构成,明确当地野生动物携带的病原谱。对感染汉坦病毒和Beilong病毒的动物样本,使用组织研磨液接种Vero细胞,同时使用SPF级鸡胚进行病毒分离,设计特异性引物,经PCR扩增获得相关序列,构建系统发育树,明确相关毒株的遗传进化特征。研究取得结果如下:1.采集褐家鼠、黄胸鼠、臭鼩鼱等小型野生动物15种,获得组织样本570份,分成21组进行病毒宏基因组测序。测序后去除宿主基因后共获得1,363,138条序列,其中被注释为病毒、细菌、真菌的序列数量分别为184,495(13.53%)、1,164,824(85.45%)和13,818(1.01%)。被注释的病毒涵盖33个科55个属,病毒谱中排名前10的病毒科占99.84%以上,主要为汉坦病毒科(120,667条,65.40%)、副黏病毒科(50,751条,27.50%)、戊型肝炎病毒科(10,275条,5.56%)、小RNA病毒科(1,157条,0.62%)。在黑龙江省褐家鼠样本中发现19个病毒种类,明显高于其它动物,其中汉坦病毒占70.82%。在云南省黄胸鼠YNRF1,黄胸鼠YNRF2和黄胸鼠YNRF3样本中发现戊型肝炎病毒(46.93%,43.48%和6.04%),在褐家鼠RHRN1样本中发现Beilong病毒(28.86%)。2.采集的动物样本共注释出199个细菌目411个细菌科。细菌reads排名前10的目约占全部目的88.87%以上,主要为假单胞菌目(Pseudomonadales,29.83%)、伯克氏菌目(Burkholderiales,16.08%)、肠杆菌目(Enterobacterales,9.11%)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales,9.04%)、根瘤菌目(Rhizobiales,6.38%)、丙酸杆菌目(Propionibacteriales,6.11%)、黄色单胞菌目(Xanthomonadales,3.80%)、乳杆菌目(Lactobacillales,3.70%)、棒杆菌目(Corynebacteriales,2.41%)和梭菌目(Clostridiales,2.37%),其中,褐家鼠携带细菌种类最多,达169个目。假单胞菌目主要集中在褐家鼠与黄鼬中,伯克氏菌目集中在褐家鼠与松鼠中。此外,在褐家鼠中发现有大量机会致病菌,如约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、食酸代夫特菌(Delftia acidovorans)、奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella osloensis)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、假单胞菌(Pseudomonas)、大肠杆菌(Escherichia coli)等。3.从黑龙江采集的褐家鼠中分离出汉坦病毒3株,属于SEOV型,与2017年山东毒株的序列高度同源;从黑龙江采集的褐家鼠中分离出Beilong病毒6株,与2019年武汉毒株的序列同源性很高,但是独立分支,可能为Beilong病毒新分型。本研究显示黑龙江和云南地区小型野生动物体内存在大量可能对人类与动物致病的病原体,如黑龙江褐家鼠携带汉坦病毒与Beilong病毒,褐家鼠与松鼠携带假单胞菌。不同地区不同动物间病原谱存在显著差异,可能由自然环境因素和人类活动因素共同影响造成。分离到的汉坦病毒与新型Beilong病毒,丰富了我国野生动物携带病毒库,更新了对黑龙江和云南地区野生动物携带病毒种类和分布的认识,为后续相关病原体的致病性研究提供了基础。本研究相关结论提示对野生动物携带病原体进行长期动态监测,对于新发再发传染病的防控有重要意义。