花生过敏影响全世界约5%的儿童和1.4~2%的成人的健康,是人类健康的重大威胁之一,其中Ara h 1是花生主要过敏原之一。已有的研究显示热处理会改变花生的致敏性,实验室前期研究结果表明,水煮和油炸会导致花生致敏性降低,而烘烤处理可以使花生致敏性升高,推测烘烤时发生的糖基化反应影响了花生过敏原的致敏性。故本文以花生Ara h 1蛋白为研究对象,原核表达重组Ara h 1蛋白,用干热法模拟糖基化反应获取终末糖基化Ara h 1蛋白,并分析了干热处理导致Ara h 1蛋白结构的改变;进一步以BALB/c小鼠和RBL细胞为致敏性评估模型综合评估糖基化对花生Ara h 1致敏性的影响;并在此基础上研究了糖基化修饰影响Ara h 1致敏性的机理,揭示了糖基化修饰对过敏原在过敏反应的各个阶段产生的影响。主要研究内容和结论如下:1重组花生Ara h 1蛋白和糖基化Ara h 1蛋白的获取提取花生总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增得到Ara h 1基因序列,将该序列克隆至pET-28a载体中,构建Ara h 1-pET-28a表达载体,进行验证和测序,将测序成功的质粒转入Rosetta(DE3)表达宿主菌中诱导表达,将以包涵体形式表达的重组蛋白溶解后透析复性,镍柱纯化获取重组蛋白,经质谱鉴定为重组花生Ara h 1蛋白(R-Ara h 1)。用干热处理模拟糖基化反应,随处理时间增长蛋白中游离氨基含量减少、结合糖含量增多,有果糖胺和高荧光水平小分子产生,推测有糖基化反应发生,质谱检测和ELISA结果表明,在100℃干热处60min后有终末糖基化特征结构产生,表明获取了终末糖基化Ara h 1蛋白(AGE-Ara h 1)。2糖基化修饰对重组花生Ara h 1蛋白致敏性影响的研究用BALB/c小鼠和RBL细胞致敏性评估模型分别研究了糖基化修饰的重组花生Ara h 1蛋白的致敏性。用AGE-Ara h 1蛋白以皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠,结果表明与对照R-Ara h 1相比,AGE-Ara h 1致敏的小鼠体重增长率较低,脾脏质量分数较高,空肠和肺出现了更严重的炎性浸润和充血现象,腹腔灌洗液中的肥大细胞和嗜碱性粒细胞有更高程度的脱颗粒现象;此外小鼠血清中有更高含量Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)、特异性抗体(IgE、IgG)和组胺,小肠和肺中有更高水平的TSLP基因表达,表明糖基化组小鼠体内有更严重的Th2型过敏反应;RBL细胞实验表明,AGE-Ara h 1致敏的小鼠血清有更高的使RBL脱颗粒能力。综上所述,AGE-Ara h 1致敏性更高,即糖基化修饰上调了R-Ara h 1蛋白的致敏性。3糖基化反应上调花生Ara h 1蛋白致敏性的机理研究本文通过模拟胃液消化实验、IgE结合力实验和树突细胞、RBL细胞模型分析了糖基化反应对重组Ara h 1蛋白在过敏反应不同阶段产生的影响,结果表明糖基化修饰使花生Ara h 1抗消化能力上升;树突细胞对糖基化Ara h 1有更高的摄取能力,且糖基化Ara h 1可上调树突细胞RAGE表达和IL-10释放;最后虽然糖基化使Ara h 1与IgE的结合能力略有下降,但增加了使RBL细胞脱颗粒的能力,进而引发更严重的过敏反应。