Hsa-miR-125a-5p调控Rab25-PI3K/AKT通路在NSCLC-TKIs耐药中的作用研究

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目的:耐药是影响EGFR-TKIs临床疗效的主要因素之一。本课题拟在诱导厄洛替尼耐药细胞基础上,通过一系列实验探讨miR-125a通过Rab25参与NSCLC EGFR-TKIs获得性耐药的相关机制。方法:1.miR-125a-5p、Rab25在肺腺癌中表达与TKIs耐药的关系:通过PCR检测3对亲本株及对应的耐厄洛替尼细胞株(A549/A549ER,PC9/PC9ER,HCC827/HCC827ER)中miR-125a-5p、Rab25的表达,分析其相关性。2.Hsa-miR-125a-5p与Rab25靶向调控关系验证:通过生物信息学软件预测miR-125a-5p与Rab25 3’-UTR结合区域,构建Rab253’-UTR-WT及对应的突变载体Rab253’-UTR-MU、miR-125a-5p过表真核载体,使用双荧光素酶报告基因检测miR-125a-5p与Rab25 3’UTR区的结合情况。3.miR-125a-5p及Rab25在TKIs获得性耐药的机制:分别构建靶向干扰Rab25基因的慢病毒载体及过表达miR-125a的慢病毒载体,经病毒包装、浓缩后感染PC9ER,采用CCK-8法检测耐药性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化,q RT-PCR和western-blot检测Rab25、Akt、Caspase-3、PARP、EGFR、Bcl-2、BAX m RNA及蛋白的表达。结果:1.miR-125a-5p在TKI耐药株中呈低表达、Rab25在TKI耐药株中呈高表达,且两者均与TKI耐药显著性相关。2.生物信息学显示,miR-125a-5p与Rab25有相关作用的区域,位于Rab25 3’UTR区的120-126 nt。成功构建Rab25基因3’-UTR双荧光素酶报告基因载体及其突变型载体,miR-125a过表达真核载体。双荧光素酶报告基因实验显示组4(Rab25 3’UTR+miR-125a-5p)与组2(Rab25 3’UTR+miRNA-NC)比较荧光素酶活性显著下降,P=0.0489,差异具有显著性;组6(Rab25 3’UTR-MU+miR-125a-5p)与组4(Rab253’UTR+miR-125a-5p)比较荧光素酶活性显著升高,P<0.0001,差异具有显著性;其余各组荧光素酶活性表达均无显著差异。上述结果证实Rab25基因miR-125a-5p直接作用的靶基因,且miR-125a-5p结合于Rab25基因的3’-UTR区域,在转录后水平对Rab25基因有直接抑制作用。3.成功构建并鉴定干扰Rab25及过表达miR-125a-5p的慢病毒表达载体。CCK-8实验发现干扰Rab25及过表达miR-125a-5p能降低厄洛替尼对PC9ER细胞耐药指数,发挥逆转耐药的作用。流式分析发现干扰Rab25及过表达miR-125a-5p能增加厄洛替尼介导的PC9ER细胞凋亡及G0/G1期细胞阻滞。Real-Time RT-PCR及WB发现干扰Rab25及过表达miR-125a-5p均能使PC9/ER细胞内的Rab25、Bcl-2、PARP及Akt m RNA和蛋白的表达下调,尤其以AKT的磷酸化水平下调明显,能够增加BAX的m RNA及蛋白表达水平,增加C-PARP的蛋白表达水平。结论:1.miR-125a-5p及Rab25在肺腺癌中均呈差异性表达,与TKI耐药显著性相关。2.Rab25基因是has-miR-125a-5p直接作用的靶基因,且miR-125a-5p结合于Rab25基因的3’-UTR区域,在转录后水平对Rab25基因有直接抑制作用。3.miR-125a-5p能逆转TKI的获得性耐药,其机制可能与抑制Rab25及其下游PI3K/AKT信号通路活化及凋亡相关信号通路激活有关。
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