目的 钠／二羧酸转运蛋白-3(NaDC 3)在肾近曲小管细胞基底侧有较多表达，主要负责摄取三羧酸循环中间代谢产物—二羧酸类物质如琥珀酸，与衰老有一定关系。是目前研究的热点之一。但NaDC3对细胞能量代谢的影响还不清楚。另外，能量代谢异常是肾小管细胞常见的凋亡原因，多功能细胞因子Ang Ⅱ和NaDC3在急性能量代谢紊乱所致细胞凋亡中的作用也不甚了解；AngⅡ对hNaDC3在肾近曲小管细胞表达有无影响也不清楚。本研究的主要目的是在细胞水平探讨人NaDC3(hNaDC3)对肾近曲小管细胞能量代谢的作用；hNaDC3和AngⅡ对急性ATP缺乏诱导凋亡的影响；AngⅡ对hNaDC3在人肾近曲小管细胞系(HKc)细胞表达的军医进修学院博士学位论文中文摘要调节作用。方法第一:利用基因转染技术构建hNaDC3不同表达的HKC细胞系，以细胞膜和线粒体膜电位的新型荧光探针DIBAC4(3)和JC一1分别标记，流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测活细胞质膜和线粒体膜电位(△平m)，用反相一高压液像法和lumin。1(3一aminophthalhydrazide)加辣根过氧化物酶诱导定向化学发光，BPCL一超微弱发光分析仪分别测定细胞ATP，HZOZ的生成量。以毛细管电泳法测定细胞对琉角酸的摄取功能，用梯度差异离心法分离细胞线粒体，测定寡霉素敏感的细胞上清液中无机磷生成量而确定细胞线粒体F禹一ATPase活性，用Cl ark电极法测定细胞基础耗氧量，寡霉素敏感的耗氧量，解偶联耗氧量和Na‘主动转运(哇巴因敏感的耗氧量)，以及Na丫k+一ATPa Se活性等指标，比较NaDC3不同表达细胞能量代谢差异。第二:应用无葡萄糖的Ringer buffer十小剂量氧化磷酸化解偶联剂CCCP+玻角酸的方法(RC法)，建立HKC细胞急性能量代谢紊乱的凋亡模型;此后再用DMEM十Angn+琉拍酸，进一步评价hNaDC3和Angll对凋亡模型的影响。第三:90%融合的HKC细胞，无血清oMEM孵育2 4h，军医进修学院博士学位论文中文摘要再在含Angn和/或ATI，ATZ受体拮抗剂的DMEM孵育24h，应用Northern bl。t，sorthern bl()t，和细胞免疫荧光技术结合流式细胞仪，激光共聚焦显微镜技术，检测hNaDC3 mRNA和蛋白水平结果:与正常HKC比较，hNaDC3高表达细胞唬角酸转运加快，细胞膜荧光强度降低，膜Na‘/k+一ATPa se活性增加，HZOZ生成增快，胞浆ATP含量增高，总耗氧量，基础耗氧量，解偶联耗氧量及哇巴因敏感的耗氧量线增多。线粒体膜JC一1红色荧光强度和FoF厂ATPase活性增加(p<0.01);但hNaDC3低表达细胞，这些指标并无明显差别(p>.05)。本文应用改良的RC方法成功建立了急性能量代谢紊乱诱导HKC细胞凋亡的模型。RC诱导4，J、时后，hNaDC3高表达细胞的凋亡率和凋亡指数显著高于NaDC3正常表达和低表达的HKC细胞(P<0.001)，但后两者比较无明显不同;HKC细胞能量代谢明显紊乱时(RC诱导4小时，凋亡模型建立)，Angn随浓度增大，短时间内(1一4，J、时)刺激凋亡模型发生凋亡的效应增强，ATI和ATZ受体阻断剂分别能部分阻断Allg11的促凋亡效应(P<0.001)，其作用可能与刺激细胞活性氧的生成有关。琉拍酸对凋亡模型呈“抛物线形影响”，低浓度时随浓军医进修学比博士学位论文中文摘要 度增大，刺激凋亡发生，生理浓度的唬角酸促凋亡效应最为明显 (p<0.01)，过高的浓度的琉角酸则又抑制凋亡发生。但在能量 代谢急性轻度异常(RC作用小于2小时，无明显细胞凋亡发生)， 在生理浓度的琉角酸存在时，Angll短时间内(1一4，卜时)呈剂 量依赖性的抑制凋亡的发生(P<0.01)。AngH低剂量(10一，’一10一gM) 刺激hNanC3在HKC细胞的表达，而大剂量(<10一，M)抑希，{NaoC3表 达;拮抗ATI受体能阻断Angn这一效应，拮抗ATZ受体对hNaDC3 表达无影响。结论:hNaDC3促进人肾近曲小管上皮细胞能量代谢和转运功能。急性能量代谢明显紊乱时，高表达hNaDC3的细胞易发生凋亡;Angll对HKC细胞的凋亡效应的短时作用与细胞能量代谢的状态密切相关。AngH经ATI受体双相调节hNaDC3在HKC细胞的表达。