目的：　　罗氏沼虾(Macrobrechium rosenbergii)又名马来西亚大虾，现广泛养殖于浙江、江苏等地。病毒是罗氏沼虾育苗过程中的主要病原，经研究发现其主要病原为一种新的双顺反子病毒，命名为罗氏沼虾双顺反子病毒(M.rosenbergiidicistrovirus，MrDV)。罗氏沼虾是无脊椎动物，不具备获得性免疫;因此，通过构建抑制性消减杂交文库，筛选获得其免疫抗病相关细胞因子进行深入研究意义较大。无脊椎动物精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)催化精氨酸与三磷酸腺苷(ATP)之间的可逆性反应，在能量代谢中具有重要作用，同时与机体的病原识别、免疫反应等多种重要的生理过程密切相关。　　方法：　　1.文库构建:　　(1)取6000尾左右的罗氏沼虾7日龄健康幼体，分成实验组、空白对照组;实验组为浸泡感染双顺反子病毒后的幼体，空白对照组为未浸泡感染的幼体。感染方法:在30℃提取液中浸泡感染10min后，暂养在4L的海水里，养殖温度为30℃，加氧气泵供氧，随后分别于0h、24h和48h采集幼体各约200尾，提取总RNA。　　(2) SMART PCR cDNA合成:选取BD Clontech公司Super SMARTTM PCR cDNASynthesis Kit进行，分别取1μg实验组及空白对照组的罗氏沼虾幼体总RNA合成SMART PCR cDNA。　　(3) SSH文库构建:选取BD Clontech公司PCR-SelectTMcDNA Subraction Kit进行SSH文库构建。经过两次消减杂交和两次抑制性PCR，构建罗氏沼虾幼体双顺反子病毒感染SSH cDNA文库。　　(4)文库筛选及基因序列分析，获得相应序列号:①序列比对和同源性分析:NCBI数据库中的BLAST;②序列功能注释和分类使用:Gene Ontology工具。　　(5)罗氏沼虾免疫相关基因差异表达特性研究:用Q-PCR验证部分差异表达基因是否筛选正确。　　2.AK基因研究:　　(1)取4500尾左右的罗氏沼虾7日龄健康幼体，分成3个组别，即实验组、阴性对照组、空白对照组;每个组设3个平行组。实验组为浸泡感染双顺反子病毒后的幼体，阴性对照组为浸泡感染健康罗氏沼虾幼体提取的上清后的幼体，空白对照组为未浸泡感染的幼体。感染方法:在30℃提取液中浸泡感染10min后，暂养在4L的海水里，保持温度为30℃，保持光照并加氧气泵供氧，随后分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h和48h采集每个培养盒中的幼体约20尾，并进行总RNA提取。　　(2)采用TRizol法提取罗氏沼虾幼体中总RNA，参照SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit说明书进行RACE-PCR扩增全长cDNA。　　(3)用MEGA6.0对获得的氨基酸序列进行多重比对和同源性分析，同时绘制系统进化树。采用Swiss-model软件对罗氏沼虾AK进行蛋白特征和结构的预测。　　(4)荧光定量PCR:按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒操作，进行实时定量PCR反应，用统计学软件SPSS17.0进行数据分析。　　结果：　　1、对构建的罗氏沼虾cDNA文库进行大规模EST测序，对获得的EST序列进行序列分析，从有差异表达的EST序列中选择了一个与甲壳动物的AK基因有高度相似性的EST序列作为研究对象。该序列与安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)的AK基因的同源性为79％，与多齿新米虾(Neocaridina denticulata)AK基因的同源性为97％，与南极磷虾(Euphausia superb)AK基因的同源性为82％，与鲑鱼海虱(Lepeophtheirus salmonis)AK基因的同源性为83％。　　2、将扩增得到的MrAK基因3末端片段连入载体pEASY-T5后，转化到Trans-T1感受态细胞中，筛选阳性克隆用载体通用引物M13进行序列测定，测序结果去载体序列后得到的AK的3末端序列，长度为570bp，与EST片段拼接并校正后得到全长序列，长度为1740 bp(Genebank: KT970484)，包括一个102bp的5，端非编码区以及一个570bp的3端非编码区，一个1068bp的开放阅读框(ORF)，该ORF编码一段包含355个氨基酸的蛋白序列。　　3、采用空间结构预测软件Swiss-model获得的MrAK的空间结构进行预测，发现罗氏沼虾AK与果蝇(Drosophila melanogaster)及家蚕(Bombyx mori)的AK的空间结构非常的相似。构建的系统进化树显示罗氏沼虾(HQ191218)的AK与多齿新米虾(AB472045)的AK首先聚类在一起，然后与鱼虱的AK聚类在一起，这三个物种的AK与水蚤并列形成一个大的分支，罗氏沼虾AK与蟹的AK亲缘关系较近，其次是对虾类。MrAK基因在进化分类中的地位与传统分类学中其所在的位置相符合。　　4、为了探讨罗氏沼虾AK基因在罗氏沼虾幼体抗双顺反子病毒感染中的作用，使用QPCR技术检测罗氏沼虾AK基因在双顺反子病毒感染罗氏沼虾幼体不同时间段(0-48h)mRNA的表达变化谱。结果如图6显示，双顺反子病毒感染罗氏沼虾幼体后9h，12 h和24 h表达量显著上调，其中感染后12 h表达量达到峰值，为阴性对照组的7.7倍(P＜0.05)。而在感染后的3h，6h和48h，变化不显著。　　结论：　　本研究通过构建罗氏沼虾双顺反子病毒刺激前后的罗氏沼虾幼体构建抑制性消减杂交文库，验证差异基因，并从中筛选获得与潜在免疫反应相关的精氨酸激酶基因进行研究。其全长1740bp，可以编码355个氨基酸。通过BLAST同源性及你发多序列比对分析可以发现，与安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)的AK基因的同源性为79％，与多齿新米虾(Neocaridina denticulata)AK基因的同源性为97％。　　通过对感染不同时间的罗氏沼虾幼体中AK基因表达差异的研究，我们发现在12h达到峰值，随后开始下降，达到初始水平。说明MrAK基因表达的确受双顺反子病毒感染的影响，很可能是免疫抗病相关细胞因子，为进一步深入研究罗氏沼虾和双顺反子病毒感染相互关系及其抗感染机制奠定基础。