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转移因子(TransferFactor,TF),是由免疫细胞产生可以将免疫信息转移到其它个体的一类多肽与核酸的混合物。本实验通过对透析液中多肽和核糖核酸含量的测定,比较了反复冻融法和细胞裂解液处理法这两种方法对转移因子提取效果的差异,并进一步讨论了冻融法中不同解冻方式和冻融次数对转移因子收率的影响。在用细胞裂解液处理脾脏淋巴细胞时,通过细胞计数的方法确定了Tris的基本浓度,同时比较了不同SDS浓度裂解液对细胞破碎效果的差异。
聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic,polyI:C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基互补配对形成的双链RNA,是一种高效的干扰素诱导剂。本研究首次用基于SYBRGreenⅠ荧光染料与双链RNA(dsRNA)结合产生荧光,加热使双链解开引起荧光减弱的原理,建立一种对特定双链聚肌胞含量检测的方法。同时通过对聚肌胞在兔血清和鸡血清中的降解的检测,初步了解聚肌胞在这两种动物机体内的降解情况。现研究结果如下:
1.脾脏组织用去注射水匀浆比用生理盐水匀浆的效果更好,表明注射水与脾脏细胞膜之间形成的渗透压差更容易破碎细胞膜,使其内容物释放出来;反复冻融6次时的转移因子中多肽浓度和核酸含量最高,过多的冻融次数反而会使转移因子中的多肽和核酸的含量变少,这可能是过多的反复解冻会对多肽和核酸产生破坏,致使其含量降低;同时,也会使细胞内溶酶体裂解,释放出水解酶,水解了转移因子中的多肽物质。上清液透析24小时转移因子的的率最高。同样的,透析时间延长并不能使透析液中的转移因子的含量增加,反而会减少。在化学破碎法提取转移因子时,先通过镜检细胞计数确定化学裂解液的初步配方。确定Tris含量为2.5%时细胞破碎率更高。通过不同浓度SDS的用量,不同透析时间的选择,发现SDS含量为0.7%,透析24小时的转移因子的含量最高。这两种方法为工业提取转移因子提供了工艺参考基础。
2.通过用SYBRGreenⅠ荧光染料与聚肌胞结合,用荧光定量PCR测定其融解曲线,发现聚肌胞浓度在0.025mg/ml~2mg/ml之间线性关系良好,由于融解曲线能特定反映的是双链核酸的解链温度时的荧光量和完全解链后的荧光量的差值与温度的变化,故此方法能特定检测dsRNA或dsDNA,特异性较高,解决了以前荧光法、紫外分光法和定磷法等的特异性差的缺点;实验发现不同动物血清中RNA酶活性对聚肌胞的降解作用有差异,其中,鸡血清对聚肌胞的降解最明显,而兔血清对聚肌胞降解稍差。鸡血清在加入聚肌胞以后4小时和24小时的荧光量几乎没有变化,一直比较低,几乎立即就被降解掉。而兔血清加入聚肌胞后4~24小时之间的荧光量是缓慢减少,说明聚肌胞在兔血清中降解的比较慢。这为将来聚肌胞在动物中的用药的研究提供了一些参考。