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[目的]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)属于黄病毒科瘟病毒属的负链RNA病,该病毒主要引起腹泻、持续性感染、免疫抑制和母畜流产等主要症状。目前随着我国养牛业的快速发展,给我国的畜牧业发展带来了严重损失。根据BVDV能否在培养的细胞中产生致细胞病变的效应,将其分为致细胞病变BVDV (cpBVDV)和非致细胞病变BVDV(ncpBVDV)两种生物类型,其中cpBVDV能够使宿主细胞产生凋亡。探讨cpBVDV诱导宿主细胞产生凋亡的机制有助于我们开发针对病毒感染高效的生物治疗方法。[方法](1)构建MDBKCs和BMDBKCs两个样品的cDNA文库,结合Solexa高通量测序技术和生物信息学方法鉴定miRNA的表达谱,利用qRT-PCR对表达差异显著的miRNA (miR-129-3p、miR-33a、miR-532、bno-miR-2、bno-miR-69和bno-miR-160)进行验证;(2)荧光显微镜观察cpBVDV感染的MDBK细胞形态变化,利用流式细胞仪检测感染细胞凋亡率;(3)利用qRT-PCR检测cpBVDV感染的MDBK细胞中miR-33a的表达水平;(4)利用Targetscan软件预测miR-33a的靶基因,构建重组载体pMD18-MAP3K33’UTR和双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K33’UTR,限制性核酸内切酶SACI/XHO I进行双酶切鉴定并测序,双荧光素酶基因检测法进行靶基因验证;(5)qRT-PCR检测转染miR-33a NC(阴性对照)和miR-33a mimics的MDBK细胞中miR-33a的表达水平;(6)采用qRT-PCR和Western blot分别检测靶基因MAP3K3和抗凋亡基因BCL-2的转录水平以及蛋白水平:(7)利用流式细胞仪检测转染细胞的凋亡率。[结果](1)鉴定出221个已注释miRNAs和239个新miRNAs以及miRNAs的表达谱,qRT-PCR验证结果与Solexa高通量测序结果基本一致;(2)cpBVDV感染的MDBK细胞形态发生改变,细胞凋亡率随感染时间延长而升高;(3)cpBVDV感染的MDBK细胞中miR-33a的表达水平升高;(4)获得miR-33a的靶基因MAP3K3,重组载体pMD18-MAP3K33’UTR和双荧光素酶重组表达载体pmirGLO-MAP3K33’UTR构建成功,miR-33a可直接靶向MAP3K3;(5)转染miR-33a mimics的MDBK细胞中miR-33a的表达水平随时间延长而升高;(6)转染miR-33a mimics的MDBK细胞中靶基因MAP3K3和抗凋亡基因BCL-2的转录水平和蛋白水平均显著降低;(7)转染miR-33a mimics的细胞凋亡率明显升高。[结论]以上结果表明miRNA-33a通过靶向MAP3K3并作用于下游的抗凋亡基因BCL-2诱导MDBK细胞产生凋亡。本研究为我们开发针对病毒感染更高效的生物治疗方法提供了新的思路和发展前景。