论文部分内容阅读
目的乳腺癌是一种较常见的女性恶性肿瘤之一,严重影响了女性的身心健康,甚至于危及其生命。手术切除、化学药物治疗（化疗）、放射治疗、内分泌治疗以及免疫治疗等多种方法的综合治疗被认为是乳腺癌的最佳治疗手段。化疗在综合治疗中起着不可替代的作用,然而长期化疗会导致乳腺癌耐药。声动力疗法（SDT）是一种新兴的肿瘤治疗方法,利用超声波对生物组织的较强穿透力激活声敏剂,产生活性氧（ROS）发挥抗肿瘤作用,同时SDT可以通过降低P-糖蛋白（P-gp）表达,激活线粒体凋亡通路来逆转肿瘤耐药。本课题制备了一种结构简单却能够高效逆转乳腺癌耐药的化疗药物与声敏剂共载的纳米体系,该纳米体系以蒽环类抗肿瘤药物阿霉素（DOX）与声敏剂血卟啉（HP）通过分子间作用力形成疏水纳米核（HP/DOX）,高分子表面活性剂普朗尼克F68包覆疏水纳米核形成亲水外壳,进而组装成为具有核-壳结构的纳米胶束（HPDF）。本研究希望通过高效共载两种不同作用机制的抗肿瘤药物,联合SDT与化疗,克服化疗耐药,获得对乳腺癌协同增效的治疗疗效。内容本论文包括以下两个章节的内容。第一章节:制备及表征HPDF纳米胶束,并对声敏剂HP与化疗药物DOX的载药量和包封率进行测定。第二章节:体外考察HPDF纳米胶束联合超声对乳腺癌细胞耐药性的逆转效应,初步探讨HPDF纳米胶束联合超声对乳腺癌细胞耐药性的逆转机制。方法1.制备及表征载药纳米胶束,并测定载药量与包封率:采用薄膜水化法制备HPDF纳米胶束;通过透射电子显微镜和电位-粒径仪表征其形态、粒径及分布的情况;采用超高效液相（UPLC）的方法考察HPDF纳米胶束中DOX与HP的载药量与包封率,并评价其对DOX和HP的携载能力。2.HPDF纳米胶束对乳腺癌细胞耐药性的逆转效应考察:使用CCK-8试剂盒检测游离DOX与HPDF纳米胶束联合超声对正常乳腺癌细胞MCF-7及其耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的细胞毒性,同时算出半数抑制浓度(IC50);利用流式细胞术分析HPDF纳米胶束以及HPDF纳米胶束联合超声对耐药细胞株MCF-7/ADR凋亡的诱导及其对细胞周期的影响作用,综合评价HPDF纳米胶束联合声动力与化疗对MCF-7/ADR细胞耐药性的逆转效应。3.耐药性的逆转机制探讨:利用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测MCF-7/ADR细胞中HPDF纳米胶束携载化疗药物DOX的入胞及其胞内分布情况,初步评价HPDF纳米胶束对P-gp外排功能的抑制;采用荧光探针法考察HPDF纳米胶束结合超声触发MCF-7/ADR细胞中ROS的生成效率,利用免疫荧光技术考察MCF-7/ADR细胞中细胞色素c（Cyt c）的胞内分布,评价线粒体凋亡通路的激活情况,探讨SDT效应对乳腺癌细胞耐药性的逆转作用。结果1.成功构建了共载DOX与HP的纳米体系,HPDF纳米胶束,该纳米胶束呈现规则球形,具有典型的“核-壳”结构,平均粒径为77.8±17.5 nm,粒径分布均匀;HP与DOX通过疏水作用力和氢键等作用高效负载于HPDF纳米核,载药量分别为12.6%和3.0%。2.与游离DOX相比,HPDF纳米胶束联合超声对乳腺癌细胞MCF-7与乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒性显著提高,并且表现出对MCF-7/ADR细胞一定的选择性;HPDF纳米胶束联合超声对MCF-7/ADR细胞具有明显的凋亡诱导作用,还表现出显著的细胞周期阻滞作用,细胞周期阻滞于S期（DNA合成期）。3.HPDF纳米胶束能够抑制P-pg的药物外排作用,有效携载DOX进入MCF-7/ADR细胞中发挥细胞毒作用;HPDF纳米胶束结合超声能够触发MCF-7/ADR细胞中ROS的大量生成,破坏线粒体膜,促进Cyt c从线粒体释放进入向细胞质,进而激活线粒体凋亡通路。结论该研究成功制备了共载HP与DOX的HPDF纳米胶束,具有经典的核-壳结构,粒径小于100 nm,分布均匀。HPDF纳米胶束联合超声表现出对MCF-7/ADR细胞耐药性的显著逆转效应,可有效携载DOX进入细胞,高效抑制细胞的生长,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期于S期,同时还能有效激活细胞线粒体凋亡通路。可见,HPDF纳米胶束能够有效联合SDT与化疗,逆转乳腺癌耐药,发挥对乳腺癌协同增效的治疗作用。