论文部分内容阅读
第一部分:视网膜Müller细胞的培养及FK506半数抑制率研究 目的:培养、鉴定视网膜Müller细胞，检测FK506对视网膜Müller细胞的IC50，为FK506对Müller细胞的生物学作用研究提供实验基础。 方法:采用含10％胎牛血清的DMEM培养基(含D-葡萄糖5.5mmol/L)，培养大鼠永生化视网膜Müller细胞。Müller细胞培养12、24、48h倒置显微镜下观察Müller细胞形态并照相记录。以谷氨酰胺合成酶(GS)免疫细胞化学染色鉴定。MTT法检测FK506作用于视网膜Müller细胞的生长抑制率。 结果:光镜观察见Müller细胞呈典型的多角形，细胞大小均匀，细胞边界清晰，形态无明显差异。Müller细胞GS抗体免疫细胞化学染色(+)，细胞质中和细胞膜上出现棕黄色、棕褐色颗粒状或者网状物质。MTT法检测Müller细胞的生长抑制率，FK506IC50=75pg/ml。 结论:Müller细胞生长良好，FK506的IC50=75pg/ml。 第二部分:FK506对高糖培养视网膜Müller细胞VEGF表达的影响 目的:采用FK506干预大鼠视网膜Müller细胞，观察其对Müller细胞VEGF基因表达的影响，从而探讨FK506对高糖培养的视网膜Müller细胞中VEGF基因表达的调控作用。 方法:采用常规DMEM培养基(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L)，配制高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L)。分组：正常对照组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L)，FK506组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L+FK50675pg/ml）,高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L)，高糖+FK506组（D-葡萄糖浓度50mmol/L+FK50675pg/ml）。ELISA检测FK506对常规和高糖培养条件下的大鼠视网膜Müller细胞上清中VEGF的表达。RT-PCR检测Müller细胞中VEGF基因的表达。 结果:ELISA检测各组Müller细胞中VEGF浓度：结果表明高糖组比正常对照组细胞上清中VEGF的表达浓度升高（P<0.05）。在高糖+FK506组较单纯高糖组细胞上清中VEGF的表达浓度降低（P<0.05）。 RT-PCR检测各组的光密度值：高糖组较正常对照组的视网膜Müller细胞VEGF基因mRNA的表达增高（P<0.05）；高糖+FK506组较高糖组VEGF基因mRNA的表达降低（P<0.05）。 结论:FK506可抑制高糖培养的视网膜Müller细胞VEGF的表达。 第三部分:FK506对高糖培养视网膜Müller细胞凋亡的影响 目的:观察FK506对高糖培养视网膜Müller细胞凋亡的影响。 方法:采用常规DMEM培养基(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L)，配制高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L)。实验分组：正常对照组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L)，FK506组(D-葡萄糖浓度5.5mmol/L+FK50675pg/ml）,高糖组(D-葡萄糖浓度50mmol/L)，高糖+FK506组（D-葡萄糖浓度50mmol/L+FK50675pg/ml）。流式细胞仪检测视网膜Müller细胞凋亡比例。免疫细胞化学染色检测FK506对常规及高糖培养条件下的大鼠视网膜Müller细胞中的P53、Bcl-2、Fas及caspase-3表达的影响。 结果:FCM检测各组凋亡比例：提示高糖组较正常对照组的凋亡比例明显上升(P<0.05)；高糖+FK506组比高糖组的视网膜Müller细胞的凋亡比例下降(P<0.05)。 免疫细胞化学染色检测各组的OD值：a.高糖组视网膜Müller细胞P53、Fas及caspase-3的表达较正常组升高（P<0.05）；FK506+高糖组比高糖组视网膜Müller细胞P53、Fas及caspas的表达明显降低（P<0.05）。b.高糖组视网膜Müller细胞Bcl-2的表达较正常组降低（P<0.05）；FK506+高糖组比高糖组视网膜Müller细胞Bcl-2的表达明显升高（P<0.05）。 结论:FK506可抑制高糖培养的大鼠视网膜Müller细胞的凋亡。