甲状腺癌是头颈部常见的肿瘤,也是最常见的内分泌系统恶性肿瘤。甲状腺癌的发病率约占甲状腺肿瘤的5%,占全身恶性肿瘤的1%左右。女性发病率是男性的3~4倍,是危害女性健康的十大癌种之一。甲状腺癌死亡率约为6.8/10万,是死亡率最低的五种癌症之一。来源于滤泡上皮的分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌和滤泡癌,占甲状腺癌的90%以上。甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid cancer,PTC)是最常见的病理类型,占甲状腺癌的80%。当前临床指南推荐细针穿刺细胞学检查(Fine needle aspiration,FNA)作为甲状腺癌最有效的诊断方法。但受到多种因素的影响,如穿刺部位、采集方法和检测技术的限制,导致约20%的甲状腺结节误诊或漏诊。因此,寻找准确、敏感的诊断技术如基于分子生物学的诊断技术对甲状腺癌的个体化医疗非常必要。甲状腺癌的标准治疗通常包括手术治疗、促甲状腺激素抑制治疗,甲状腺残体的放射性碘(RAI)治疗。尽管甲状腺癌的预后良好,仍有约5%的患者会出现转移性疾病,该群体缺乏具体的、有效的治疗方法。寻找有效的治疗靶点和靶向药物将助于进一步提高该部分甲状腺癌的治疗效果。三叶因子3(Trefoil factor 3,TFF3)是三叶因子家族中发现最晚的小分子分泌性多肽,人TFF3由42个氨基酸残基通过二硫键折叠而成三叶草结构域。越来越多的证据表明,TFF3在癌症的发生和进展中有至关重要的作用。已经发现TFF3mRNA和蛋白在不同的实体肿瘤过表达,包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌和结肠癌、子宫内膜癌和肝细胞癌,并促进癌细胞迁移、入侵、增殖、生存和血管生成。然而,Takano等首先发现甲状腺滤泡癌中TFF3下调。随后科学家以免疫组织化学发现乳头状和未分化癌TFF3蛋白质低表达。但本课题组前期工作表明:PTC中TFF3高表达,且与淋巴结转移和临床分期有关。本实验将利用体内、外实验进一步研究TFF3在PTC发生发展中的作用机制。目的:检测甲状腺乳头状癌手术标本中tff3的表达及其与临床病理参数的关系,探讨tff3在甲状腺乳头状癌中的临床意义。方法:商用ptc组织芯片购于上海芯超生物技术有限公司,新鲜手术标本源于2014年河北北方学院附属第一医院甲状腺癌手术标本。取材前均经患者知情同意,标本经两名病理医师明确诊断。对组织芯片进行免疫组化染色;新鲜手术标本部分用于原位杂交染色,部分用于rt-pcr法检测内源基因tff3mrna的转录水平。结果:1组织芯片中tff3蛋白表达31例乳头状癌乳头状结构明显,毛玻璃样核、核型不规则、核沟明显可见。阳性产物高表达于胞浆,癌旁滤泡上皮细胞为立方形,tff3阴性或弱阳性。ptc组织tff3阳性率和aod值明显高于癌旁组织。伴淋巴结转移的ptc病例tff3全为阳性(15/15),无淋巴结转移者阳性率68.75%(11/16),其表达水平(aod值)在淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(p<0.05)。临床Ⅲ~Ⅳ期患者tff3的阳性率100%(20/20)明显高于Ⅰ~Ⅱ期54.54%(6/11)患者(p<0.05)。2tff3mrna原位杂交tff3mrna阳性信号为蓝色颗粒,位于胞浆。癌组织阳性信号明显高于癌旁,差异具有统计学意义(p<0.01)。3ptc中tff3rt-pcr结果tff3mrna和β-actin的扩增产物分别在100~200bp和200~500bp之间清晰扩增带。甲状腺乳头状癌tff3/β-actin比值明显高于癌旁组织(p<0.01)。小结:1tff3蛋白和mrna在甲状腺乳头状癌上皮细胞高表达。2ptc中tff3蛋白高表达与淋巴结转移和临床分期有关。第二部分人tff3shrna表达质粒的构建及有效序列筛选目的:构建针对人tff3的shrna表达载体,瞬时转染自身表达tff3的甲状腺乳头状癌k1细胞,筛选出靶向人tff3的最有效的sirna序列。第一部分甲状腺乳头状癌标本tff3的表达及临床意义1根据genbank中登录的人tff3mrna序列,利用invitrogen公司网站在线设计软件分别在人tff3基因mrna的132?170、258和537bp处作为潜在靶位点,合成4条sirna转录模板的发夹结构(shrna1~4)以及1条阴性对照(shrnac)。按照sense+loop+antisense+终止信号的原则设计shrna序列,并由广州复能基因生物有限公司合成。体外退火后插入plvx-shrna-puro载体构建重组质粒,酶切鉴定,并测序。2shrnas质粒瞬时转染甲状腺乳头状癌k1细胞,转染48小时荧光显微镜观察转染细胞的效率。3转染shrna-tff3后各组细胞quantitativereal-timepcr(qpcr)和westernblot检测tff3mrna和蛋白的沉默效率。结果:1人tff3shrna表达载体酶切鉴定plvx-shrna2-puro-tff3质粒用xhoi做酶切鉴定。将鉴定的阳性质粒送交公司测序,结果证明shrna3,4插入序列与原设计序列完全一致,shrna1,2发生了突变,后续实验舍去。2各组细胞质粒转染后荧光表达结果k1细胞转染48小时后,倒置荧光显微镜观察显示,各质粒转染组的细胞中可见明显的绿色荧光,表明重组质粒已成功转入细胞。其中shrna3、shrna4和shrnac组荧光细胞数量分别占细胞总数的(79.83±2.3)%?(71.7±3.0)%?(70.45±2.0)%,各组细胞荧光强度基本一致;未转染组k1细胞未见荧光?3各组细胞tff3mrna表达量分析转染48h,与shrnac组相比,shrna3、shrna4组tff3mrna水平显著降低(均为p<0.01),qpcr显示shrna3和shrna4组tff3mrna沉默效率分别为60.67%和57.33%。4各组细胞tff3蛋白表达量分析westernblot结果显示:shrna3、shrna4组tff3蛋白的表达量明显低于未转染组和对照组(p<0.01)。小结:1本实验成功设计并构建成功2组特异性靶向人tff3基因的shrna方法:慢病毒载体。2重组载体瞬时转染后的两组k1细胞株,通过qpcr和westernblot检测,在转录后和翻译水平上显著抑制了tff3基因的表达,证实所构建的靶向tff3基因的重组shrna慢病毒载体是成功、有效的。第三部分慢病毒介导shrna靶向下调tff3对人乳头状癌tpc-1细胞生物特性的影响目的:构建shrna靶向下调tff3表达的乳头状癌tpc-1细胞稳转株;检测沉默tff3基因对tpc-1细胞的体外生物学特性的影响及可能的作用机制。方法:1慢病毒包装293t细胞及病毒滴度测定。2本研究中将采用慢病毒感染法构建乳头状癌tpc-1细胞稳转株;并以quantitativereal-timepcr和westernblot检测shrna-tff3-tpc-1细胞tff3的沉默效率。3检测沉默tff3对tpc-1细胞生物学特性的影响:克隆形成实验和cck-8检测tff3基因对tpc-1细胞增殖能力、划痕实验及transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力、细胞侵袭实验检测侵袭及粘附能力,quantitativereal-timepcrpcr和免疫印迹检测凋亡相关指标bax和bcl-2的水平改变。结果:1慢病毒包装和稳转细胞株的筛选shrhac和shrna-tff3慢病毒载体经293t细胞包装后可在荧光显微镜493nm下激发绿色荧光。慢病毒rlv-tff3滴度为:5.0x107tu/ml;rlv-shrnac滴度为:1.0x109tu/ml。经过数日筛稳转细胞株shrna-tff3-tpc-1与空载体稳转株shrnac-tpc-1细胞发出明亮的荧光,未转染的tpc-1无绿色荧光。2shrna-tff3-tpc-1和shrnac-tpc-1稳转细胞株的鉴定qpcr显示:沉默组比对照组tff3mrna转录水平明显降低(p<0.01)。westernblott结果显示:与对照组相比shrna-tff3干扰组tff3蛋白的表达显著降低(p<0.01)。免疫细胞化学染色显示tff3蛋白位于细胞质,未转染tpc-1和shrnac组胞质呈tff3强阳性,shrna-tff3干扰组tff3阳性信号明显减弱(p<0.01)。3沉默tff3基因tpc-1细胞增殖能力下降克隆形成实验结果显示,未转染组tpc-1细胞和shrnac组细胞形成克隆数目平为(28.7+3.6)个和(33.7+4.1)个,shrna-tff3干扰组形成克隆数目平均为(20.7+2.9)个,与tpc-1和shrnac组相比克隆形成数量减少(p<0.05)。cck-8细胞增殖能力检测显示,sitff3明显抑制了tff3细胞的增殖能力。与tpc-1和shrnac组相比,实验组shrna-tff3细胞株增殖能力明显受到了抑制(p<0.01)。三组细胞在day2~day4进入对数生长期,但沉默细胞株shrna-tff3在day2~day4的od值明显低于正常tpc-1和对照株shrnac(p<0.01)。4细胞迁移能力通过细胞划痕修复实验发现:划痕后12h和24h与0h相比,划痕12h时三组划痕宽度差异无统计学意义,24htpc-1、shrnac和shrna-tff3组划痕宽度分别为26μm、17μm和75μm,shrna-tff3组细胞的迁移能力明显低于shrnac组及tpc-1组(p<0.01),而shrnac组及tpc-1组之间的无差异(p>0.05)。transwell迁移实验显示:shrna-tff3组上室细胞穿膜到达下室的细胞明显少于shrna组及tpc-1组,10%乙酸洗脱后,酶标仪检测三组吸光度值,沉默组吸光度值为0.8088±0.0012明显低于shrnac组的1.1590±0.009122和tpc-1组的1.1950±0.02800,差异具有统计学意义,p<0.01。5细胞侵袭能力transwell侵袭实验结果:与shrnac组及tpc-1组比较,shrna-tff3组上室细胞侵袭到下室的细胞数明显下降(p<0.01),shrnac与tpc-1两组间无显著性差异(p>0.05)。10%乙酸洗脱后,酶标仪检测三组吸光度值,shrna-tff3沉默组明显低于shrnac组及tpc-1组。6细胞粘附能力三组细胞培养2h后吸弃未粘附的细胞后,贴壁细胞经cck-8法检测各组od值,结果:三组细胞株总体粘附性有差异。其中,shrna-tff3粘附率为5.16%,显著低于shrna(p<0.05)。7tff3基因沉默促进tpc-1凋亡(1)qpcr检测bcl-2、bax基因转录水平qpcr结果显示:三组细胞均检测到了bcl-2mrna、baxmrna的表达,对数据进行分析发现shrna-tff3组促凋亡基因bax明显高于对照组shrnac,而抗凋亡基因bcl-2则低于对照组,均为p<0.01。(2)bcl-2和bax蛋白水平变化westernblot法检测结果提示:shrna-tff3组与shrnac组和tpc-1组相比,bcl-2蛋白明显减弱,bax蛋白明显增强。差异具有统计学意义(p<0.05)。(3)tunel原位凋亡tunel染色阳性细胞细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚,呈棕黄色或黄褐色颗粒,胞质着色浅,呈现凋亡的形态学特征。shrna-tff3组tunel阳性细胞数多于shrnac组及tpc-1。小结:1通过慢病毒侵染方法成功构建了敲低表达tff3的甲状腺乳头状癌shrna-tff3-tpc-1细胞株。2tff3基因沉默可以降低tpc-1细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力,并促进细胞凋亡。3tff3基因沉默促进bcl-2下调,bax上调。第四部分shrna-tff3-tpc-1细胞在裸鼠体内的成瘤作用目的:裸鼠皮下接种人tpc-1细胞株,制作人甲状腺乳头状癌细胞裸鼠模型,观察tff3基因沉默后对裸鼠体内肿瘤组织生长能力的影响,在体验证shrna沉默tff3基因的生物学效应。实验动物分组。方法:1实验分组36只裸鼠,雌雄各半,随机分为三组,即正常对照组:裸鼠右侧腋窝中部外侧皮下注射tpc-1细胞。空载体shrnac组:裸鼠皮下注射shrnac-tpc-1细胞悬液。基因沉默shrna-tff3组:裸鼠皮下注射shrna-tff3-tpc-1细胞悬液。2细胞体外培养三组tpc-1细胞在5%co2、37℃正常条件下培养。制成1~2×105个细胞/ml的细胞悬液,待种。3瘤细胞悬液接种及瘤体观察75%医用酒精棉球消毒裸鼠右腋下皮肤,摇匀细胞悬液,取0.2ml(细胞数5×105)缓慢注射于小鼠右腋部皮下。每日观察小鼠状态和移植瘤发生及生长情况。记录三组移植瘤发生时间点,隔2日称重测量肿瘤一次,并用游标卡尺测量瘤体大小,绘制裸鼠移植瘤体积生长曲线。4继续饲养并连续观察裸鼠情况,于最后一次肿瘤测量后,移出无菌层流室,每组各取雌雄各3只行小动物活体成像然后安乐死处死动物。取出肿瘤标本,拍照;取癌组织块,称重后,切取2/3冻存于-80℃冰箱,其余部分制作蜡块。5he染色及免疫组化染色瘤体经bouin’s液固定12h,逐级梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡,常规石蜡包埋。切片厚5?m、he染色。6肿瘤组织rna提取及quantitativereal-timepcr,检测tff3干扰表达tpc-1肿瘤中tff3mrna水平结果:1裸鼠生长状态三组细胞移植后tpc-1组和shrnac组第7天成瘤,shrna-tff3组第10天成瘤。各组裸鼠1~3周生长状态良好,活动、进食均无异常,体重稳步增长,第3周体重停止增长或增长缓慢。2shrna-tff3对tpc-1细胞移植瘤生长的影响第7天tpc-1组和shrnac组开始触及瘤体,tff3沉默组第10天开始成瘤,并快速生长。但tff3沉默组裸鼠皮下移植瘤不仅成瘤滞后,而且生长速度明显滞后于其余两组。小动物活体成像可见瘤体发出绿色荧光。shrna-tff3与shrnac组相比瘤体小,且荧光强度弱。雄性鼠瘤体大于雌性。第28天,shrna-tff3组裸鼠肿瘤体积明显小于shrnac组和tpc-1组,差异具有统计学意义(p<0.05)。结果表明,敲低tff3基因的表达能明显抑制裸鼠移植瘤模型中TPC-1细胞的成瘤能力和肿瘤的生长能力(P<0.05)。3.TFF3基因敲低对移植瘤重量的影响在第28天观察期结束后,将各组裸鼠处死,完整切取皮下肿瘤的瘤体。称取三组肿瘤的重量。sh RNA-TFF3组瘤体的重量明显低于未转染组和空载体组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.瘤体HE染色及免疫组织化学染色HE染色结果显示瘤组织为癌细胞特点,可见病理性多核及核分裂相,细胞间可见少许结缔组织。TFF3免疫组化染色可见免疫反应阳性细胞胞质呈黄色或棕黄色,shRNAC和TPC-1组TFF3阳性信号强,shRNA-TFF3组几乎阴性。各组瘤内TFF3蛋白比较:与未转染组和shRNAC组比较,shRNA-TFF3组蛋白表达显著降低,而未转染组和shRNAC组间无统计学差异(P<0.01)。5移植瘤组织中TFF3mRNA水平移植瘤qPCR结果显示:沉默TFF3基因组TFF3mRNA水平低于未转染组和shRNAC组(P<0.01)。稳定敲低TFF3的TPC-1细胞在裸鼠体内稳定,与体外沉默相近。小结:1甲状腺乳头状癌TPC-1裸鼠移植模型成功建立。2在体内实验,敲低TFF3基因表达的TPC-1细胞能显著抑制肿瘤增长。乳头状癌TPC-1细胞裸鼠模型的体内实验结果同体外细胞学功能实验结果一致。结论:1甲状腺乳头状癌高表达TFF3与淋巴结转移及临床分期有关。2敲低内源性TFF3表达,乳头状癌的TPC-1细胞生长受抑制、侵袭能力降低,体内、外成瘤能力降低,可能通过促进bcl-2下调,bax上调促进TPC-1细胞凋亡影响细胞的生物学特性。3 TFF3基因可以作为人类甲状腺乳头状癌潜在的治疗靶点。