在正常生长条件下,植物细胞的多种代谢反应都会产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)。一定浓度的ROS是植物生长所必须的,而低温、高温、盐渍、干旱、臭氧等胁迫则可导致ROS大量产生,若未及时清除,ROS便会攻击蛋白质、核酸、脂类等生物大分子引起氧化损伤,进而导致细胞及组织死亡。植物叶绿体是ROS产生的主要部位之一,环境胁迫下叶绿体内ROS的快速清除有助于保护光合机构,维持植物光合功能。抗坏血酸(AsA)是植物体最主要的水溶性抗氧化物质,可以直接清除单线态氧、超氧阴离子自由基和H202,抗坏血酸还可以作为APX及AsA依赖型加双氧酶的辅酶、参与水—水循环清除H202,且可以作为紫黄质脱环氧化酶的辅因子参与叶黄素循环,此外,抗坏血酸在植物的生长、开花、衰老、细胞程序性死亡及抵抗各种逆境胁迫中起着重要作用。GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGP)是植物AsA合成的关键酶,因此研究GGP基因与植物抗逆性的关系具有重要意义。本研究从番茄叶片中克隆了GDP-L-半乳糖磷酸酶基因(SIGGP),并对该基因的表达和功能进行了分析。主要结果如下：(1)利用同源序列设计引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到全长cDNA,命名为SIGGP (JQ517313)。该基因全长为1495bp, ORF为1314bp,编码437个氨基酸,分子量约为49kDa,具有两个保守区—HIT (histidine triad)和NLS (nuclear localization sequence)。(2)将p35S-S1GGP-GFP融合蛋白在洋葱表皮瞬时表达。通过荧光显微镜观察到SlGGP基因产物定位于细胞质和细胞核。(3) qRT-PCR分析表明,SIGGP在叶片中含量最丰富,其次是花,根中表达量最低。同时该基因的表达受低温、NaCl、MV胁迫诱导。(4)将获得的SIGGP与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄和烟草,用PCR及qRT-PCR的方法对带卡那抗性的转基因番茄和烟草植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义的烟草植株和转反义基因的番茄植株。与野生型相比,转反义SIGGP的番茄叶片的抗坏血酸含量降低为野生型番茄的50%-75%左右,转正义SIGGP烟草抗坏血酸含量升高了约87%-115%。(5)转反义基因番茄抗坏血酸合成途径(Smirnoff-Wheeler途径)中其他相关酶的基因在转录水平的表达受到影响,位于SIGGP上游的基因,特别是GME表达上调。(6)构建了原核表达载体pET-SlGGP,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为1：1000。Western杂交表明,低温诱导SlGGP在蛋白水平的表达,转反义基因番茄株系SlGGP在蛋白水平的表达明显受到抑制,转正义基因烟草株系SIGGP在蛋白水平的表达增高。(7)在低温弱光(4℃,100μmol m-2s-1)胁迫条件下,野生型和转反义基因番茄的净光合速率(Pn)和PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)下降,但与野生型相比,转反义基因株系T1-1,T1-3和T1-5的下降更为明显。这表明抑制SIGGP的表达加剧了PSⅡ的光抑制。在低温弱光处理过程中,转基因植株与野生型的氧化态P700降低,转反义基因三个株系下降更明显。经过6h低温处理,转反义基因和野生型的H202和O2-含量及相对电导率均增加,转反义基因植株显著高于野生型。这些结果表明,抑制番茄SlGGP的表达,降低了AsA的含量,增强了转反义基因番茄的冷敏感性。在烟草中过表达SIGGP可以增强烟草抗低温胁迫的能力。低温弱光胁迫后,转正义SIGGP烟草的AsA还原状态高于野生型,同时表现出较高的抗氧化酶(APX、SOD和POD)活性和D1蛋白含量,PSⅠ和PSⅡ受抑制程度较低。(8)在MV处理下,野生型烟草的离体叶圆片发生比转基因烟草更严重的光漂白,转基因烟草的AsA含量、生长量、抗氧化胁迫能力都高于野生型,并且转基因烟草比野生型具有更高的净光合速率(Pn)和光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光化学速率(Fv/Fm)。结果表明,SIGGP的过表达有助于提高烟草AsA含量及抗氧化胁迫能力。