丝状真菌烟曲霉是一种条件致病菌,其产孢能力强,通过空气传播,在环境中无处不在,会引发人类侵袭性曲霉病,免疫缺陷人群一旦感染,致死率达90%以上。治疗侵袭性曲霉病的药物包括唑类药物(如伊曲康唑)、棘白菌素类药物(如卡泊芬净)、多烯类药物(如两性霉素B)等,其中唑类药物因抗菌谱较广、副作用较小而成为最常见的治疗曲霉病药物。近年来,唑类药物的广泛应用导致耐药菌株出现频率增加,对于这种耐药菌株,如何选择有效治疗药物成为难题,因此研究烟曲霉耐药性产生机制,开发提高功效、降低抗药性的新型抗真菌药物具有重要意义。唑类药物主要作用于烟曲霉羊毛甾醇14-α-去甲基化酶Erg11A,erg11A突变是烟曲霉产生唑类药物耐受的最常见机制,研究证明,erg11A的过表达与烟曲霉的唑类抗性存在直接关系,而erg11A在转录水平发生的变化除了由基因突变引起外,也与转录因子的调节相关。erg11A受到固醇调节原件结合蛋白SrbA与CCAAT结合复合物(CBC)的协同调控,其中CBC由三个亚基Hap B、Hap C、Hap E组成,这三个亚基对于体外形成CBC都是必要的,单独敲除任何一个均会致使烟曲霉出现生长缓慢、分生孢子减少等一致的表型。CBC与SrbA竞争性结合erg11A启动子中特定的34聚体区域。在唑类抗性突变菌株中,34聚体发生串联重复突变(TR34),使得SrbA结合的两个甾醇调节元件SRE1、SRE2得到有效复制,而CBC结合位点CGAAT则因与SRE存在部分重复,大大降低了与CBC复合物的亲和力,最终导致erg11A表达增加。SrbA除了在调控麦角固醇生物合成中有重要作用外,还与烟曲霉的低氧适应性相关,我们尤其注意其在低氧诱导条件下的作用模式。正常情况下SrbA以非活性形式与膜结合,而低氧刺激时,SrbA受到Dsc复合物依赖性蛋白水解和Spp A蛋白顺序切割。随后被激活的SrbA进入细胞核与靶基因启动子中的甾醇调节元件(SRE)结合并激活靶基因的表达。SrbA与CBC对erg11A的协同调控至关重要,这种协同调控仅仅通过简单的竞争性结合erg11A启动子区吗?是否存在其他更为复杂的调控方式呢?本文发现在唑类药物处理条件下,SrbA蛋白与在低氧诱导条件下情况相似,由定位于内质网的全长蛋白,发生切割,转变为定位于细胞核的成熟核蛋白以发挥转录因子的作用。并且我们构建了srb A~T菌株,用直接表达SrbA成熟核蛋白的方式证实了SrbA以成熟核蛋白形式发挥作用,引起Erg11A的高表达,从而导致srb A~T菌株产生唑类抗性。此外,本文还首次发现CBC的Hap B亚基缺失会增加SrbA成熟核蛋白的含量并延长其在细胞核中的滞留时间,此外,我们还发现Hap B缺失提高Dsc蛋白复合物中Dsc B、Dsc C、Dsc D和Dsc E以及Spp A蛋白的表达,这也可能是其缺失影响SrbA切割的原因。总之,先前的研究中,都普遍认为CBC与SrbA竞争性结合erg11A的启动子从而协同调控erg11A,但我们的研究发现除了占位原理外,Hap B还对SrbA的蛋白切割和定位有重要影响,本研究发现了唑类药物靶标蛋白Erg11A的新调控机制,为进一步理解烟曲霉菌株的唑类耐药性产生机制提供了一定的基础。