研究背景肝癌是肝脏最常见的原发肿瘤,其中肝细胞肝癌（heptocellular carcinoma,HCC）在我国占原发性肝癌的90%。全世界每年死于此病约一百万人,晚期肝癌预后差,总体5年生存率小于5%。首先,原发性肝癌的恶性程度高、危害大,多数患者未能早期发现和早期诊断,就诊时多数属于中晚期,失去手术机会,因此,早期发现、早期诊断和早期治疗是提高HCC患者生存和预后的重要因素,诊断阳性率的提高对HCC患者生存率及生存质量改善至关重要。甲胎蛋白（AFP）临床应用主要有两点:首先发现和监测原发性肝细胞癌,其次监测治疗效果。虽然AFP检测已广泛用于原发性肝癌的诊断中,但由于某些肝癌细胞不分泌此种糖蛋白。故在这些原发性肝癌患者体内无法测到异常的AFP。而在某些慢性肝病、肝硬化及生殖腺胚胎癌时,患者血清中的AFP也有中等水平的表达。所以仅凭AFP诊断原发性肝癌易造成漏诊和误诊,故其临床应用受到一定限制。其次,转移和复发也是影响肝癌生存率的主要因素。探讨肝癌发生发展、转移复发相关分子机制、及寻找新的干预靶点已经成为肝癌研究的重点和难点。在肝癌的治疗方面,对于不能手术切除的晚期肝癌,肝动脉介入化疗栓塞疗法和化疗是最主要的治疗手段,但无论是介入治疗还是化疗,都只能使少部分患者获益,大部分患者疗效不佳,而且也不能为患者带来生存受益。如阿霉素是传统的用于肝癌治疗的药物,但缓解率仅为10%～15%,且不能延长患者的生存时间。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,新的生物治疗药物不断涌现,生物靶向治疗已逐渐成为晚期肝癌病人的新选择、新希望。现阶段,分子靶向治疗和以此为基础的放射免疫靶向治疗在晚期肝癌的治疗上取得了令人鼓舞的良好疗效,逐渐成为晚期HCC病人的首选治疗手段。肝肠钙粘连蛋白（CDH17）包含了832个氨基酸残基,分子量约92.3kD,属于钙粘连蛋白家族成员,但其结构特点和生物学行为均与传统的钙粘连蛋白有所不同。CDH17细胞外部分具有7个结构域,细胞粘附识别区域（cell adhesionrecognition CAR）介导钙粘连蛋白的特异性粘附,细胞质部分含有20个氨基酸残基。有研究表明,CDH17的胞外部分可能独自担当调节细胞粘附功能的工具。正常情况下,CDH17限制性地表达在鼠的肝脏及大肠小肠细胞内,而在食管和胃从未发现CDH17的存在。钙粘连蛋白是Ca²⁺依赖的细胞之间的粘附分子,它们在胚胎的发生发育及组织器官的形成和结构维持中发挥了重要的作用。如果钙粘连蛋白功能紊乱将会使细胞之间的粘附力下降,细胞和组织形态改变,从而出现细胞迁移。这个现象出现在肿瘤组织中将会导致肿瘤细胞向外周浸润或转移。因此,钙粘连蛋白可视为肿瘤患者的病情及预后检测指标之一。尽管CDH17的结构与传统钙粘连蛋白不同,但在上述功能中也起到了同等重要的作用。CDH17的功能紊乱将导致肿瘤细胞的外周浸润及转移,最终导致肿瘤复发及总体生存率的下降,一系列研究的结果提示CDH17可能成为胃癌、结肠癌及肝癌等肿瘤诊断和/或预后的指标,监测肿瘤的进展及复发。但CDH17在肿瘤发生发展过程中的具体作用还不十分明确,制备CDH17的单克隆抗体将为CDH17的功能研究提供条件。本研究以纯化的重组CDH17为免疫原,利用经典的淋巴细胞融合技术,建立了稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,对得到的单克隆抗体进行了纯化和鉴定,并用Western-Blot和免疫组织化学实验对所制备的抗体进行了验证,再用制备出的抗CDH17单克隆抗体作用于人肝癌HepG2细胞,探讨其抑制肝癌细胞增殖的作用,为进一步研究CDH17的功能奠定了基础。目的制备及鉴定肝肠钙粘连蛋白（CDH17）的单克隆抗体,研究其对肝癌细胞系HepG2的生长抑制作用,为探讨CDH17蛋白的生物学功能奠定基础。方法1动物免疫选用BALB/c小鼠,用纯化的蛋白免疫,间接ELISA检测血清抗体效价达1∶6 400以上。2细胞融合末次免疫后3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。3杂交瘤细胞株的制备和筛选采用间接ELISA方法,用纯化的重组CDH17融合蛋白筛选只与CDH17反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,行1次亚克隆及2-3次单克隆。4诱生腹水和抗体的纯化在预先1周注射石蜡油致敏的BALB/c小鼠腹腔接种已建株的杂交瘤细胞,采集腹水,通过Protein—G亲和层析柱纯化,SDS—PAGE分析纯化结果。5 Western-Blot分析取分别含肝癌细胞系HepG2、QGY7703、Be17402、CBRH7919的上样进行SDS-PAGE电泳,一抗加入抗CDH17单克隆抗体细胞株培养上清F001和F002（原液）。6免疫组织化学分析收集经手术切除的病理证实为原发性肝细胞癌的组织标本,用制备的单克隆抗体进行免疫组化染色以分析CDH17在原发性肝细胞癌组织中的表达情况。对照组以PBS代替第一抗体。7单抗作用于HepG2后细胞形态的观察取对数生长期HepG2细胞接种于6孔板,培养12 h后加入不同浓度的抗CDH17单克隆抗体,其终浓度分别为0（对照组,加入同体积的培养基）、5ug/ml、10 ug/ml、20 ug/ml、40 ug/ml、80 ug/ml,药物处理后24、48、72和96h在倒置显微镜下连续观察细胞形态学变化并拍摄记录细胞形态。8 MTT法检测各浓度单抗对肿瘤细胞增殖的抑制取对数生长期HepG2细胞接种于96孔板,培养12 h后加入不同浓度的抗CDH17单克隆抗体,其终浓度分别为0（对照组,加入培养基）、5ug/ml、10 ug/ml、20 ug/ml、40 ug/ml、80 ug/ml,分别培养24、48、72和96h后用MTT法检测各浓度单抗对肿瘤细胞增殖的抑制。9统计学处理实验所得数据应用SPSS15.0统计软件进行处理。以析因设计的资料方差分析对各浓度组及各时间组的抑制率进行差异性分析,并用SNK法分别对其进行两两比较。P＜0.05为差异具有统计学意义。结果1杂交瘤细胞株的建立获得分泌稳定的单克隆抗体杂交瘤细胞株2株,命名为F001和F002。2 McAb的效价ELISA检测两株单抗（F001和F002）的细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶1024,腹水效价为1∶25600和1∶51200。3抗体的纯度测定纯化后的2株单克隆抗体经SDS—PAGE电泳,抗体纯度达80%以上。4 Western blot结果结果显示CDH17在HepG2、QGY7703、Be17402和CBRH7919中均有不同程度的表达,2株单抗均能检测到与CDH17（约92.3KD）预测分子量大小一致的特异条带。表明以重组纯化的CDH17为免疫原产生的McAb可与真核细胞内的天然CDH17抗原结合。5免疫组化染色结果两株抗CDH17单克隆抗体与原发性肝细胞癌组织反应后均能生成棕色或棕褐色沉淀,主要位于肝癌细胞的胞质,阴性对照未见棕色或棕褐色沉淀。6单抗作用于HepG2后细胞形态学改变加药24、48、72和96h后,对照组细胞生长良好、数量随生长时间增长而增多,细胞大小均匀、形态一致并呈多边形,高倍镜下可见细胞染色质疏松、胞质丰富。实验组细胞培养48h后,各实验组均可见细胞数量明显减少,细胞大小不一,形态不规则,部分细胞变圆,高倍镜可见细胞核固缩、胞质减少以及胞质内出现空泡,部分细胞脱壁呈半悬浮状态,细胞数量及形态改变与药物作用时间和浓度呈正相关。7 MTT法检测各浓度单抗对肿瘤细胞增殖的抑制经析因方差分析得不同药物浓度之间及不同作用时间之间的平均抑制率存在显著差异,且两因素之间存在交互效应。说明药物浓度和作用时间两因素对抑制率起相互促进的作用。再进行单独效应分析,相同作用时间不同药物浓度之间及相同药物浓度不同作用时间之间的抑制率存在显著差异,不全相同。进一步用SNK法对单独效应进行两两比较的结果显示,除了80ug/ml药物浓度下作用72h与96h无显著差异外,相同作用时间不同药物浓度之间及相同药物浓度不同作用时间之间均存在显著性差异。证明了抗CDH17单克隆抗体对HepG2细胞增殖的抑制作用随浓度的增加和作用时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用逐渐增强,但当药物浓度达到80ug/ml时,作用72h或作用96h并无显著差异。结论本实验运用杂交瘤技术成功筛选并制备出2株抗CDH17的单克隆抗体细胞株,并对其特异性进行鉴定,经Western-blot和免疫组织化学鉴定,显示制备的2株单克隆抗体均能和人肝癌细胞株以及人原发性肝癌病理标本发生特异性反应,表明制备的单克隆抗体特异性针对CDH17。进一步利用MTT法测定抗CDH17单克隆抗体对人肝癌细胞的生长抑制作用,表明抗人CDH17单克隆抗体对HepG2细胞增殖的抑制作用呈时间和浓度依赖性,随浓度的增加和作用时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用逐渐增强,并且时间与剂量之间有协同作用。