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缺血性心脏疾病——心肌供血不足是威胁人类健康的头号杀手之一。冠状动脉阻塞引起心肌梗死,伴随心肌细胞大量死亡,损失的心肌细胞将被没有收缩功能的疤痕组织所替代,最终导致心力衰竭。由于心肌细胞再生能力有限,因此进行细胞移植,用功能性心肌组织替代受损心肌是治疗心肌损伤的根本途径[1-2]。近年来,移植外源性干细胞再生心肌的治疗策略得到越来越多的关注。其中,具有无限增殖能力和多向分化潜能的ESC由于具有向心肌细胞高效分化、能够与宿主心肌整合并存在电信号传导等优势,在干细胞移植治疗心肌梗死方面,具有广阔的应用前景。然而,ESC体内移植后面临引发免疫排斥反应和致畸胎瘤形成等问题,严重限制了其在体内移植治疗器官损伤中的应用。治疗性克隆策略有望解决ESC体内移植后引发免疫排斥反应这一难题。随着组织工程研究的不断深入,运用组织工程技术研制可供移植的工程化心肌组织,为心脏缺血性疾病的治疗带来了新的希望。目前,组织工程技术治疗缺血性心脏疾病主要包括以下两个策略:1.可注射性材料携带心肌细胞进行心梗部位直接注射修复心脏损伤;2.体外构建具有一定大小、形状和力学强度的工程化心肌组织进行心梗部位移植。尽管基于可注射性工程化心肌的治疗策略在心梗治疗的研究中已经取得了诸多进展,但仍存在许多问题,如:注射移植物很难在梗死心肌薄化的瘢痕区形成适合心梗疤痕面积和形状的,足够修复疤痕的心肌组织,并且细胞滞留率较低,而移植工程化心肌组织构建物则可以克服以上限制,理论上能达到替代心脏受损组织的目的。本研究以重构胚来源的小鼠胚胎干细胞(Nuclear transferred mouse embryonic stem cell, NT-mESC)来源的心肌细胞作为种子细胞,胶原/Matrigel为支架材料,体外构建工程化心肌组织,并进行大鼠心梗部位移植,研究其对梗死心肌的修复能力。本研究是治疗性克隆策略和工程化心肌组织体外构建技术相结合治疗心肌损伤的首次尝试,对于未来治疗缺血性心脏疾病具有重要的临床意义,目前,国内外尚未见相关报道。本论文的主要研究内容包括以下三个部分:第一部分:NT-mESC的培养、向心肌细胞的诱导分化和富集获得大量状态良好的种子细胞是心肌组织工程研究的前提与基础。本部分研究目的即大规模扩增NT-mESC并进行诱导分化,以期获得充足的高质量的种子细胞。首先进行NT-mESC大规模培养扩增,并通过制备滋养层细胞以及在培养液中添加白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)来保持其多向分化潜能。当NT-mESC扩增达到一定数量后,采用STLV型生物反应器为培养载体,大规模制备拟胚体(embryoid body, EB),并用去除白血病抑制因子、添加诱导剂抗坏血酸的条件分化培养基培养EB,促进EB向心肌细胞分化早期基因的启动。在生物反应器中培养5天后,EB达到一定的大小和数量,将其转移至明胶包被的细胞培养皿中进行贴壁诱导。观察贴壁拟胚体中细胞生长迁移以及形成跳动合胞体的情况。结果发现,在贴壁诱导第14天左右,跳动EB数量达到最高峰,之后逐步下降;cTnT免疫荧光染色结果显示,诱导分化14天的EB中含有大量的cTnT阳性细胞。通过Percoll密度梯度离心的方法收集NT-mESC诱导分化来源的心肌细胞,可观察到心肌细胞主要富集在第Ⅲ层和第Ⅳ层,其心肌细胞纯度分别达到37±2%和74.5±4%。与以往大多文献报道的采用基因工程技术纯化胚胎干细胞诱导来源心肌细胞的方法相比,此方法简单有效,并且可以避免由于基因修饰所带来的安全性问题;应用此纯化方法收集的细胞在作为心肌组织工程种子细胞方面更具优势。第二部分:NT-mESC来源的心肌细胞体外构建工程化心肌组织的实验研究本研究中,我们以第一部分研究中获得的NT-mESC来源的心肌细胞为种子细胞,液态I型鼠尾胶原和Matrigel为支架材料,在自制的模具中构建工程化心肌组织片层(engineered heart tissue ,EHTs),体外静态培养7天后进行动态力学拉伸刺激,采用组织学和免疫组织化学等方法对构建的片层进行鉴定。结果发现,经过体外培养与力学拉伸刺激后,构建片层中细胞存活状态良好,多数区域可见到有序排列的长梭状心肌细胞,其发育状态与乳鼠心肌细胞较为相似,具有较高的核质比。免疫组化染色表明,构建片层中的细胞除了心肌细胞外,还有少量成纤维细胞、神经细胞和内皮细胞等,这些细胞的存在可能会进一步促进片层中心肌细胞的存活和分化成熟。本部分研究以NT-mESC来源的心肌细胞为种子细胞,在体外成功构建了EHTs,目前国内外尚未见相关报道。第三部分:工程化心肌组织大鼠心梗部位移植修复心肌损伤的实验研究为了研究上述体外构建的工程化心肌组织对大鼠梗死心脏的修复作用。本研究首先成功建立了大鼠心梗模型,心梗2周后进行EHTs的移植实验,共设立4个移植组:EHTs移植实验组,健康对照组,单纯心梗对照组和非收缩材料(noncontractile material,NCM)对照组。移植四周后对大鼠进行心脏超声检测,观察其心脏功能的改善情况,取材后进行组织学、免疫组织化学染色,研究EHTs在心梗部位的存活、与宿主的整合以及血管化情况,评价其对梗死心肌的修复效果。结果表明,移植4周后,心梗大鼠心脏的收缩和舒张功能得到显著改善。组织学与免疫组化结果表明,移植片层紧紧贴附于心梗表面,片层内部心肌细胞存活状态良好,血管化较丰富;片层中形成了较为广泛的connexin43连接,与宿主心肌亦可见部分connexin43连接,未见畸胎瘤形成。本研究表明,基于NT-mESC的体外构建的三维组织工程化心肌具有一定的心肌损伤修复能力。目前以NT-mESC为种子细胞构建工程化心肌组织并进行体内移植修复心肌梗死的研究尚未见报道。综上所述,本研究运用STLV型生物反应器进行大规模制备EB,采用Percoll密度梯度离心成功富集NT-mESC来源的心肌细胞;以NT-mESC来源的心肌细胞作为种子细胞,液态I型胶原和Matrigel为支架材料,在自制模具中成功构建出片层状工程化心肌组织(EHTs);将构建的EHTs移植到大鼠心梗部位4周后,结果显示,移植物能显著改善心梗大鼠的心脏功能,组织学和免疫组化鉴定表明EHTs能够较好地与宿主心肌整合,并有较丰富血管化的发生。本研究是治疗性克隆策略和心肌组织构建相结合治疗心肌损伤的首次尝试,对于未来治疗缺血性心脏疾病具有重要的临床意义