[背景]机械性窒息是由外界机械性暴力所引起的呼吸障碍或呼吸衰竭导致的窒息,其死亡过程较快,在法医病理学死亡原因中占有较高的比例,发生率仅次于机械性损伤导致的死亡。常见的机械性窒息类型主要包括缢死、勒死、扼死、闷死、溺死、压迫胸腹部死亡等,其主要的尸体特征有颜面部青紫肿胀、尸斑显著且广泛、牙齿浸染、内部器官瘀点性出血等。然而,有相当一部分他杀案件如捂压口鼻致死、闷死、压迫胸腹部致死、死后分尸等案件并未显示出明显的机械性窒息征象,其死亡过程迅速而又缺乏相应的目击证人,使得案件的侦破困难重重。因此,深入研究法医学中机械性窒息的发生机制以及筛选相应的生物学标志物对于辅助诊断机械性窒息导致死亡的案件具有重要的科学意义。[目的]本实验拟通过建立机械性窒息动物模型来模拟研究人窒息死亡的机制以及筛选其特征性的生物学标志物。采用死后动脉血液生化检测和组织器官蛋白质组学技术检测两种方法从两个方面同时研究机械性窒息死亡的生物化学及分子生物学指标的变化规律,以期为法医学有关机械性窒息死亡的鉴定提供一些辅助诊断指标。[方法]1.建立小鼠机械性窒息模型（家兔建模方法与小鼠相同）,分别设立对照组、缢死组和闷死组。建模成功后观察小鼠的尸表及解剖征象,HE染色观察三组小鼠的心肌及脑组织的形态学特征,TUNEL染色评估小鼠心肌及脑组织的凋亡情况。2.测定对照组、缢死组和闷死组家兔死后12h内（0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h）动脉血的生化指标,测定项目主要包括血气值（p H、Pa O2、Pa CO2）、血氧值（Sa O2、Hct、t Hb）、电解质(K+、Na+、Cl-、Ca2+)和代谢物（Lac、Glu）,观察上述指标的死后变化以及三组模型之间的差异。3.采用Label-free蛋白质组学技术检测对照组、缢死组和闷死组小鼠心肌和脑组织的蛋白组水平的差异,结合生物信息学的方法和技术分析其差异蛋白富集的通路,并筛选出与机械性窒息相关的差异蛋白,最后采用PRM及免疫组化的方法对差异蛋白进行验证。[结果]1.本实验成功建立了小鼠与家兔两种动物机械性窒息模型,在小鼠窒息模型中,尸表及解剖检查中可观察到典型的窒息征象。缢死组小鼠可见眼球突出、舌尖外露、大小便失禁等;解剖后可见小鼠颈部肌肉出血、内部器官淤血、器官被膜下瘀点性出血等;HE染色观察可见小鼠心肌间质散在出血,心肌间质小血管淤血,脑组织淤血、水肿,肺组织淤血、水肿、出血等;TUNEL染色观察可见小鼠心肌外层细胞与脑皮质浅层均出现少量的凋亡信号。闷死组小鼠濒死期可见大小便失禁、躁狂等现象;HE染色观察可见小鼠心肌间质小血管扩张淤血,局部心腔内可见散在红细胞,脑组织淤血、水肿,肺组织淤血、水肿、出血等;TUNEL染色观察显示出小鼠心肌外层细胞与脑皮质浅层均出现少量的凋亡信号。2.对照组、缢死组和闷死组家兔死后动脉血气分析结果显示,死后12h内Pa O2、Sa O2、p H、Ca2+和Glu含量随PMI的延长而逐渐降低,上述测定指标在三组之间的整体变化趋势均具有统计学差异,其中Pa O2、Sa O2、p H和Ca2+四种指标的测定结果相对比较为对照组＞闷死组＞缢死组,Glu的测定结果相对比较为缢死组＞闷死组＞对照组。死后12h内Pa CO2、K+和Lac的含量随PMI的延长而逐渐升高,Pa CO2的整体变化趋势在三组之间具有统计学差异,相对比较为缢死组＞闷死组＞对照组,K+和Lac的含量在死后12h内均达到本实验仪器测定的最大阈值,无法进行整体的统计学分析。死后12h内Hct、t Hb、Na+和Cl-四种生化指标相对稳定,无明显的变化规律。3.小鼠心肌和脑组织蛋白质组学的结果显示,缢死组vs对照组小鼠心肌组织的差异蛋白功能富集于核糖体的功能调节、心肌收缩功能与蛋白质的降解、线粒体氧化呼吸和蛋白质的折叠等方面,我们根据上述结果筛选出上调的差异蛋白主要有TITIN、PSA1、PSA6和PSB4,下调的差异蛋白主要有FIBA、FIBB、FIBG、CY1和C560。闷死组vs对照组小鼠心肌组织的差异蛋白功能富集于核糖体的功能调节、心肌收缩与钙离子调节、蛋白质的合成及代谢、凝血功能的调节、线粒体氧化呼吸等方面,筛选出上调的差异蛋白主要有CASQ2、TITIN、PSA6、PSB4和RAB7A,下调的差异蛋白主要有FIBA、FIBB和FIBG。缢死组vs对照组小鼠脑组织的差异蛋白功能富集于核糖体的功能调节、凝血功能的调节、糖原的代谢、蛋白质的降解过程、细胞凋亡的调节等方面,筛选出上调的差异蛋白主要有PP2AA、2A5G、RYR2和CO3,下调的差异蛋白主要有UBA3。闷死组vs对照组小鼠脑组织的差异蛋白功能富集于蛋白质的合成及代谢功能、核糖体的功能调节、线粒体氧化呼吸、脂肪酸氧化、糖原合成调节等,筛选出上调的差异蛋白主要有TRA2B、ACSL1和CPT2,下调的差异蛋白主要有COX6A1。采用PRM技术及免疫组化的方法对上述部分差异蛋白进行再验证,结果与Label-free蛋白质组学筛选出的蛋白质表达结果相一致,进一步证明了此蛋白质筛选方法的准确性。[结论]本实验采用死后生化检测和蛋白质组学两种技术方法对法医学中有关机械性窒息死亡的问题进行了系统性的研究。建立了机械性窒息中的缢死和闷死两种动物模型,并采用上述技术手段研究了机械性窒息的死后生化差异指标和组织学差异的分子指标,并通过PRM及免疫组化等一系列手段对筛选出的差异指标进一步验证,初步总结出了一些对机械性窒息死亡的诊断有价值的指标,生化指标如Pa O2、Sa O2、p H、Ca2+、Glu、p H值等,分子指标如FIBA、FIBB、FIBG、CASQ2、TRA2B、RAB7A等。这项研究在分子层面上填补了法医学有关机械性窒息研究的空缺,并为后续机械性窒息的深度研究奠定了基础。