研究背景人体盆底组织主要起承载人体盆腔各脏器的作用,女性盆底组织主要包括封闭骨盆出口的多层肌肉、筋膜及子宫韧带。这些组织因各种原因(如：妊娠、分娩、便秘、长期咳嗽等)发生损伤或撕裂而使其支持功能减弱时,即发生子宫及相邻的直肠、膀胱、阴道壁发生移位及功能障碍,临床上称之为盆底功能障碍疾病(pelvic floor dysunction, PFD),主要指压力性尿失禁(stress urinary incontinence, SUI)和盆腔脏器脱垂(pelvic orgen prolapse, POP)。目前治疗方法主要包括手术治疗和保守性的药物治疗及盆底肌肉锻炼等康复治疗,但这些治疗均有其不足之处。特别是韧带组织,损伤后其修复过程形成瘢痕组织,不是真正意义上的再生,同时对盆底起最主要支持力量的子宫宫骶韧带-主韧带复合体的结构功能又与PFD的发生、发展密切相关。因此,如何使损伤后的子宫韧带恢复其正常的结构和功能,是真正治疗该疾病急需解决的问题。组织工程学的诞生,为子宫韧带的修复提供了新的手段。最近的研究表明：在修复过程中,受损韧带局部出现来源于骨髓间充质的干细胞,其性状与周围的韧带成纤维细胞非常相似。在受损膝腱、髌韧带中注射入含骨髓间充质干细胞或成纤维细胞的纤连蛋白基质可影响其组织学形态、超微结构和必需的细胞外基质蛋白mRNA的表达,使受损膝腱、韧带更容易恢复。另外发现,骨髓间充质干细胞与肌腱或韧带成纤维细胞共培养后可提高兔肌腱、韧带相关基因的表达。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一种具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞,在体内、外均可定向诱导分化为具有各种表型的子代细胞。本研究旨在研究体外正常细胞及机械牵张损伤细胞在共培养体系中定向诱导BMSCs分化为子宫韧带成纤维细胞的影响。实验中用机械牵张刺激损伤体外培养的大鼠子宫韧带成纤维细胞,造成PFD的细胞损伤模型,将BMSCs与正常子宫韧带成纤维细胞和机械牵张损伤的子宫韧带成纤维细胞在体外间接共培养(非接触式)。同时,检测共培养诱导后BMSCs弹性蛋白、赖氨酰氧化酶(lysyloxidase,LOX)、Fibulin-5的表达情况,以进一步认识BMSCs的分化潜能及生物学特性。本文研究了在体外通过非接触式共培养诱导BMSCs向子宫韧带成纤维细胞的分化,为从组织工程学角度以根源上治疗PFD疾病提供可能的研究思路及新的治疗手段。研究方法1.大鼠BMSCs的体外分离培养：采用密度梯度离心法结合传代贴壁筛选法分离纯化获得大鼠BMSCs;通过形态学观察、细胞生长曲线绘制、细胞表面特异抗原及细胞周期的流式细胞学检测,对体外培养获得的BMSCs进行初步鉴定；采用体外诱导大鼠BMSCs向成骨细胞和成脂细胞的分化,对获得的BMSCs的生物学功能进行鉴定。2.大鼠子宫韧带成纤维细胞的体外分离培养及鉴定：采用大鼠子宫韧带组织块酶消化法,进行子宫韧带成纤维细胞的原代培养,通过形态学观察、细胞生长曲线的绘制及免疫组化测定其胶原Ⅰ、Ⅲ蛋白的表达对获得的子宫韧带成纤维细胞进行鉴定。3.对大鼠子宫韧带成纤维细胞进行体外机械牵张,建立机械牵张损伤模型：根据韧带成纤维细胞的生物学特性,在细胞牵张仪上采用负载10%应力,1赫兹的机械牵张刺激大鼠子宫韧带成纤维细胞3h、6h、12h、24h、36h不同时间段后,通过透射电镜、鬼笔环肽染色观察不同时间牵张损伤后成纤维细胞的超微结构和细胞骨架的变化情况；采用实时定量RT-PCR技术测定不同时间牵张损伤后成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的合成能力；用台盼蓝染色观察细胞的凋亡情况。4.大鼠BMSCs与大鼠子宫韧带成纤维细胞共培养体系的建立：将大鼠BMSCs与正常及不同牵张时间后的大鼠子宫韧带成纤维细胞间接共培养3、6、12天,采用实时定量RT-PCR检测BMSCs中弹性蛋白、LOX及Fibulin-5 mRNA的表达情况；采用免疫蛋白印记法(western-blot)检测BMSCs中弹性蛋白、LOX及Fibulin-5蛋白的合成情况。应用SPSS16.0软件包进行数据处理。所有数据结果均采用平均数±标准差(χ±s)表示。用one-way ANOVA检验样本与对照组的组间差异,以a=0.05作为检验水准。实验结果1.体外获得的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),其细胞形态均一,呈梭形、扁平形,增殖至细胞融合时,细胞为典型的长梭形,呈集落样或放射状排列,有一定的极性;检测第四代大鼠BMSCs表面特异抗原分子,99.0%以上细胞CD90表达阳性,98.8%以上的细胞CD44表达阳性,CD34、CD45均表达阴性,分别为1.8%和3.7%；细胞周期结果显示：第4代BMSCs处于G0/G1期的细胞约为80%以上,表明大多数细胞处于静止期；细胞生长曲线典型,且所得细胞可被诱导为成骨和成脂细胞,符合间充质干细胞的特征。2.体外成功获得子宫韧带成纤维细胞,细胞贴壁生长,形态呈梭形,与典型的成纤维细胞形态相似；细胞生长曲线典型,免疫组化测定其胶原Ⅰ、Ⅲ型蛋白的表达均符合韧带成纤维细胞特征。3.本实验以1Hz的强度,负载10%牵张刺激细胞,用荧光物质(鬼笔环肽和DAPI)分别对所得细胞内F-actin和细胞核进行特异性标记,结果提示：F-actin在机械牵张下发生了解聚和重排。力学牵张短时间内子宫韧带成纤维细胞未出现明显变化,长时间刺激后细胞变狭长,排列无序,超微结构出现损伤,甚至出现凋亡。4.对大鼠子宫韧带成纤维细胞中胶原Ⅰ和胶原ⅢmRNA的表达量进行检测,结果表明：牵张刺激3h、6h、12h后,胶原mRNA的表达量随牵张时间逐渐增多,牵张刺激24h、36h后,胶原mRNA的表达量随牵张时间逐渐降低,其中牵张刺激12h大鼠子宫韧带成纤维细胞中胶原mRNA的表达量最多。同时,与对照组(未受牵张刺激的正常成纤维细胞)相比,牵张刺激3h、6h、12h、24h,胶原mRNA的表达量均增加；而牵张刺激36h,胶原mRNA的表达量较对照组降低。5.通过实时定量RT-PCR和免疫蛋白印记法(Weston-Blot)对共培养3天、6天、12天的对照组、间接共培养组、牵张间接共培养组诱导后BMSCs合成分泌弹性蛋白、LOX、Fibulin-5mRNA及蛋白进行检测,结果显示：(1)共培养3天组间mRNA相对量分别为：牵张间接共培养组2.01±0.12,1.92±0.07,2.02±0.0,间接共培养组1.41±0.06,1.26±0.06,1.16±0.11,对照组1.00±0.03,1.00±0.04,1.00±0.06；蛋白相对量分别为：牵张间接共培养组0.30±0.11,0.45±0.07,0.29±0.14,间接共培养组为0.21±0.15,0.39±0.08,0.20±0.15,对照组为0.17±0.07,0.35±0.10,0.14±0.07；表达均无差异(P>0.05)。(2)共培养6天组间mRNA目对量分别为：牵张间接共培养组3.81±0.13,2.11±0.07,3.90±0.11,间接共培养组2.69±0.08,1.62±0.11,2.59±0.09,对照组1.29±0.05,1.11±0.041.21±0.07；蛋白相对量分别为：牵张间接共培养组0.45±0.09,0.61±0.14,0.37±0.07,间接共培养组0.39±0.06,0.45±0.14,0.23±0.04,对照组0.19±0.12,0.36±0.06,0.15±0.04；三组间有统计学差异(P<0.05)。进一步做两两比较,组间均有统计学差异(P<0.05),并呈线性增强。(3)共培养12天组间mRNA相对量分别为：牵张间接共培养组4.54±0.16,2.50±0.09,4.21±0.15,间接共培养组2.93±0.14,1.71±0.09,2.89±0.08,对照组1.50±0.04,1.19±0.18,1.60±0.07；蛋白相对量分别为：牵张间接共培养组0.51±0.14,0.63±0.18,0.40±0.17,间接共培养组为0.42±0.14,0.49±0.11,0.24±0.06,对照组0.20±0.13,0.38±0.15,0.18±0.06；三组间有统计学差异(P<0.05)。进一步做两两比较,组间均有统计学差异(P<0.05),并呈线性增强。结论1.负载10%形变,1Hz单项水平牵张刺激12小时损伤的细胞,可以作为较为合理的子宫韧带成纤维细胞牵张的时间和频率及强度。2. BMSCs与大鼠正常子宫韧带成纤维细胞和牵张损伤后子宫韧带成纤维细胞间接共培养,均可诱导BMSCs向子宫韧带成纤维细胞分化,但损伤细胞的定向诱导作用更强。诱导分化后的大鼠BMSCs可以合成分泌弹性蛋白、LOX、Fibulin-5,具有子宫韧带成纤维细胞的部分分泌功能。