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Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）介导的心脏免疫炎症反应是心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤的重要病理生理特征。缺血后处理（isehemic postconditioning,IPost C）即在心肌缺血后,恢复血流灌注之前给予多次短暂的心肌复灌/停灌处理,可显著减轻心肌I/R损伤。目前IPost C的心脏保护机制尚不完全清楚。我们前期的研究显示,IPost C能够上调热休克蛋白90（heat shock protein 90,HSP90）的表达水平,减轻I/R引起的心肌细胞凋亡和损伤。HSP90是如何介导后处理的心脏保护作用?近期有研究显示mi R-499对HSP90具有调控作用。因此,我们假设在缺氧后处理（hypoxia postconditioning,HPC）及IPost C中mi R-499调控HSP90的表达水平,进而调节先天免疫系统中TLR4的活化,减少心肌细胞凋亡、心肌梗死面积和炎症因子IL-1β,IL-6的释放,改善心肌缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）及I/R损伤。本研究通过建立离体心肌细胞H/R和在体大鼠心脏I/R损伤模型,实施缺氧（血）后处理,采用mi R-499过表达、抑制表达病毒载体及HSP90的抑制剂干预,随后检测全身循环及局部心肌组织中免疫炎症因子TLR4,IL-1β,IL-6的表达水平,探讨后处理中mi R-499调控的HSP90信号通路与免疫炎症间的内在联系,同时检测NF-κB信号通路,从细胞水平和在体动物水平探讨后处理中mi R-499调控HSP90的信号转导机制。本研究分两部分内容。第一部分缺氧（血）后处理中热休克蛋白90对TLR4介导的免疫炎症反应的影响目的:探讨在缺氧（血）后处理期间,HSP90通过抑制TLR4介导的免疫炎症反应来发挥缺氧（血）心脏保护作用的机制。方法:1.细胞实验部分:H9C2心肌细胞缺氧3 h后,行下列处理:（1）复氧6 h（H/R组）;（2）3个循环的复氧5 min/缺氧5 min后再复氧6 h（HPC组）;（3）应用HSP90特异性抑制剂GA后再行（2）的操作（HPC+GA组）;对照组的心肌细胞在复氧条件下培养9 h。应用CCK-8法检测心肌细胞存活率,Western blot检测HSP90,TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的蛋白表达水平。2.动物实验部分:大鼠局部心肌缺血30 min后,行下列处理:（1）再灌注2小时（I/R组）;（2）3个循环的缺血30s/再灌注30s后再灌注2小时（IPost C组）;（3）应用GA（1 mg/kg）后再行（2）的操作（IPost C+GA组）;对照组的大鼠在标准条件下培养2.5小时。应用TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡,伊文思蓝+TTC染色法检测心肌梗死面积,荧光定量PCR和Western blot检测大鼠局部心肌组织中HSP90,TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的m RNA和蛋白表达水平,以及ELISA法检测循环血液中TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的表达水平。结果:1.与HPC组比较,H/R组和HPC+GA组的心肌细胞存活率均显著降低;而H/R组和HPC+GA组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与H/R组比较,HPC组上调HSP90的蛋白表达水平,同时下调TLR4、信号因子NF-κB和炎症细胞因子IL-1β,IL-6的蛋白表达水平;而与HPC组比较,HPC+GA组下调HSP90的蛋白表达水平,同时上调TLR4、信号因子NF-κB、炎症细胞因子IL-1β,IL-6的蛋白表达水平;而H/R组和HPC+GA组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.IPost C显著降低了I/R诱导的心肌梗死面积、心肌细胞凋亡以及循环血液中TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的表达水平,而这些有益作用是通过上调HSP90的表达及抑制TLR4及其介导的炎症级联反应的激活来发挥的;但是,应用GA阻断HSP90的功能后,IPost C的心脏保护作用则大大降低,这表明IPost C具有HSP90依赖性缺血心肌的抗炎抗凋亡保护作用。结论:HSP90可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号转导通路及其介导的心肌组织局部及全身循环的炎症反应在缺氧（血）后处理期间发挥缺氧（血）心肌的保护作用。第二部分缺氧（血）后处理中mi R-499对HSP90的表达及TLR4介导的免疫炎症反应的影响目的:探讨在缺氧（血）后处理期间,mi R-499通过上调HSP90的表达并抑制TLR4介导的免疫炎症反应来发挥缺氧（血）心脏保护作用的机制。方法:1.细胞实验部分:构建mi R-499过表达、抑制表达和阴性对照慢病毒载体,转染H9C2心肌细胞;心肌细胞被分为4组:HPC组、HPC+阴性对照组（HPC+NC组）、HPC+mi R-499抑制表达组（HPC+inhibitors组）和HPC+mi R-499过表达组（HPC+mimics组）。采用荧光定量PCR检测心肌细胞中mi R-499的m RNA表达水平,CCK-8法检测心肌细胞存活率,Western blot检测HSP90,TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的蛋白表达水平。2.动物实验部分:构建mi R-499过表达、抑制表达和阴性对照腺相关病毒载体,转染SD大鼠;大鼠被分为4组（每组15只）:IPost C组、IPost C+阴性对照组（IPost C+NC组）、IPost C+mi R-499抑制表达组（IPost C+inhibitors组）和IPost C+mi R-499过表达组（IPost C+mimics组）。采用荧光定量PCR检测局部心肌组织中mi R-499的m RNA表达水平,TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡,伊文思蓝+TTC法检测心肌梗死面积,荧光定量PCR和Western blot检测大鼠局部心肌组织中HSP90,TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的m RNA和蛋白表达水平,以及ELISA法检测循环血液中TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的表达水平。结果:1.与HPC组比较,HPC+inhibitors组心肌细胞中mi R-499和HSP90的表达水平明显降低,TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的表达水平显著增高,同时心肌细胞存活率下降;而HPC+mimics组心肌细胞中mi R-499和HSP90的表达水平明显增高,TLR4,NF-κB,IL-1β和IL-6的表达水平显著降低,同时心肌细胞存活率增高;HPC组和HPC+NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.与IPost C组比较,IPost C+inhibitors组局部心肌组织中mi R-499和HSP90的表达水平明显降低,TLR4,NF-κB,IL-1β,IL-6的m RNA和蛋白表达水平、心肌细胞凋亡和心肌梗死面积均显著增高;而IPost C+mimics组则具有与之相反的结果;IPost C组和IPost C+NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。这些实验结果表明,IPost C具有mi R-499依赖性缺血心肌的抗炎抗凋亡保护作用。结论:mi R-499参与了缺氧（血）后处理介导的缺氧（血）心肌的保护作用,这可能是通过抑制TLR4、信号因子NF-κB及随后的心肌局部组织和全身循环的炎症细胞因子的激活来发挥的。