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糖尿病发病末期所导致的肾病(DN)是一种急性微血管型末期肾脏慢性疾病临床并发症，主要临床表现是因为由体内发生高血糖新陈代谢功能障碍而改变引起的，它同时也被研究认为可能是目前我国急性糖尿病最常见和高发率的临床治疗并发症之一，从当前临床发病情况分析来看，由于这种发病原因很有可能会直接导致并发终末期急性肾脏病和慢性末期肾脏病。组织间质切片从医学临床上的病理学和生理学上的角度进行分析，一般肾病突出的临床特点之一就是良性肾间质小球基底膜逐渐扩大增厚，肾间质小球逐渐扩张，结节性间质硬化，肾间质小球良性硬化，间质性硬化，炎症反应和肾小管发生萎缩等。据2019年统计结果显示，我国约有1.16亿人口为成人糖尿病病人，最终发展为糖尿病肾病的糖尿病病患比例约为25％至40％。糖尿病肾病不但让病者的正常生产工作和日常生活有较大的发病风险和精神影响，而且还给病者及他们的家人带来了严重的社会和经济负荷。目前，对于直接治疗糖尿病所引发的终末期肾脏疾病的药物在市场上几乎没有，主要采取联合使用降低血糖、降血压和降血脂药物，肾透析肾移植手术等方法。因此，开发出一种药物直接用于医治糖尿病肾脏疾病的需求十分迫切。
大蒜作为食药同源的传统中草药，已经被证明具有多种药理活性成分，具有特别的药用价值。从老蒜中分离提取出来的有机硫等一些具有活性的有效成分已经成为目前我国中药和西药研究的热点，其中SAMC(S-烯丙基巯基半胱氨酸)是一种微溶于水的有机硫化物，从蒜头中提取出来。大量文献研究表明，SAMC具有抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤、抑制粘液分泌、保肝、治疗顺铂所导致的肾损伤以及治疗急性肺损伤的作用。尽管SAMC具有较为良好的药用价值，但由于SAMC在水相和有机相的溶解度都较低，无法达到体内给药的有效剂量，SAMC的应用并没有得到有效广泛的发展。基于此，本实验课题拟通过制备SAMC的给药剂型从而提高SAMC的溶解度，达到体内外所需的给药水平，进而探究SAMC对于治疗糖尿病肾病所导致的肾纤维化作用的药效与相关分子生物学作用机制。
本课题研究的实验内容主要包罗下列三个部分:
(1)SAMC环糊精包合物(SAMC-β-CD)的制备与表征;
(2)SAMC体外抗肾纤维化作用及其相关分子生物学作用通路的探究;
(3)SAMC-β-CD体内对于糖尿病肾病引起的肾纤维化的治疗作用及作用机制的研究。
1、SAMC-β-CD的制备与表征:此项研究部分包括建立了SAMC原料药含量测定方法学的建立、筛选稳定剂、制备SAMC-β-CD的制备工艺、以包合率作为指标筛选最优良的处方、SAMC-β-CD包合物的表征以及溶解度实验验证包合作用对SAMC在水中溶解程度的影响;首先通过HPLC建立了SAMC的标准曲线并用于含量测定与后期的处方筛选;通过稳定剂筛选，实验结果显示PVP-K30是较为适宜的稳定剂，以β-环糊精作为包合材料和PVP-K30作为稳定剂对SAMC进行包合后，通过单因素筛选，进HPLC测定包合率的方法筛选出最优良的处方，实验结果表明β-环糊精与SAMC的最适宜比例为10∶1，SAMC-β-CD与PVP-K30的最佳比例为3∶1;SAMC-β-CD包合物形成的验证采取红外光谱分析方法(FT-IR)、差式扫描量热法(DSC)的表征方式;通过溶解度实验证明了SAMC原料药制备成SAMC-β-CD包合物能增加其溶解度。
2、SAMC体外抗肾纤维化作用及其相关分子生物学作用通路的探究:此项研究部分主要由体外肾纤维化模型的建立、测定细胞增殖蛋白的表达、分子信号通路的研究三个模块组成。实验方法主要是将大鼠肾系膜细胞(RMC)培养在高浓度的葡萄糖环境中，从而建立体外肾纤维化模型，观察肾纤维化细胞形态及MTT法对肾纤维化细胞活力进行测定，筛选出了最佳葡萄糖建模浓度为30mM，最适宜的SAMC给药浓度范围在5-100μM之间，进而选定10、25、50μM为低中高给药浓度;采用Westernblot法测定相关蛋白通路，以及纤连蛋白Fibronectin和增殖细胞核抗原PCNA的表达。实验结果显示出，经过SAMC的治疗，显著降低了纤连蛋白Fibronectin和增殖细胞核抗原PCNA的表达，而机制通路研究证明SAMC可以抑制RMC细胞的增殖，可以通过影响NF-κBp65机制通路来实现，说明SAMC在体外具有抗增殖及治疗肾纤维化作用。
3、SAMC-β-CD对于糖尿病肾病引起的肾纤维化的治疗作用及作用机制的研究:此项研究部分主要包括糖尿病肾病小鼠模型的建立、SAMC-β-CD对糖尿病肾病小鼠肾纤维化的治疗作用、肾脏病理组织切片检查、相关分子生物学作用机制的研究。在该临床实验中，将130mg/kg的链脲佐菌素(STZ)一次性大剂量地注射到模型小鼠的腹膜腔中，用于创建患有糖尿病性肾病的模型小鼠，注射建模药物72h后，对所有小鼠禁食不禁水8h，剪尾法检测空腹血糖，选择空腹血糖≥11.0mmol/L的小鼠进行分组;每间隔一周检查一次体重和空腹血糖。同时SAMC-β-CD(50、100 mg/kg)灌胃干预8周，依那普利(1.5 mg/kg)作为阳性药。第7周，收集一个24h小鼠尿液被应用于计算和测定一个小鼠尿中微量白蛋白水平;8周后处死小鼠，心脏灌流后收集左肾以左叶片染色时可用于观察小鼠的形态学改变、系膜扩张、细胞外基质沉积以及糖原累计情况;收集一只小鼠的血清，进行体内肾功能参数的测定;通过Westernblot方法探索其中有关的分子生物学反应机制。研究结果表明，给予SAMC-β-CD后能明显改善肾系膜纤维化，从Masson染色结果观察到肾系膜扩张现象有所缓解，PAS染色结果显示SAMC-β-CD大大降低了葡萄糖原的累积;同时尿中微量白蛋白程度也有所减少，有效地缓解了白蛋白尿现象;肾功能参数血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)均可有所减少;总甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)的减少说明由于体内高血糖浓度超出了正常体内水平导致脂质代谢紊乱的情况已经有所改善;ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6的表达水平及其RT-PCR法测定炎症因子在基因水平的表达，发现SAMC-β-CD能在体内发挥抗炎症反应的作用;Westernblot测定结果表明，SAMC降低了细胞外基质标志蛋白fibronectin、collagen-Ⅰ、E-cadherin、vimentin的表达，进而显示SAMC抗肾纤维化的疗效与影响上皮-间质转分化(EMT)相关。从上游的信号通路途径来看，SAMC-β-CD一方面可以通过影响LRP5/6的表达从而影响Wnt3a/β-catenin信号通路，另一方面通过抑制NF-κBp65/HIF-1α上游传输通路，调控下游的转录因子Snail影响EMT的过程主要是通过两条信号通路共同作用。
综上所述，本实验课题为了增加SAMC在水中的溶解度达到体内所需的给药剂量，设计制备了SAMC-β-CD，筛选出最佳工艺处方并对制剂进行了表征。采用葡萄糖刺激，建立了体外肾纤维化模型，考察验证了SAMC对于抗细胞增殖治疗肾纤维化的作用效果及其作用机制。使用STZ建立体内糖尿病肾病模型，证明SAMC-β-CD可以有效缓解糖尿病肾病所引起的肾纤维化和炎症反应，其作用机制主要是通过降低LRP5/6的表达抑制Wnt3a/β-catenin途径的激活，同时抑制NF-κBp65/HIF-1α信号通路的激活，两条信号途径共同调控EMT进程降低ECM积累，抑制STZ所导致的糖尿病肾病而引起的肾脏纤维化。
大蒜作为食药同源的传统中草药，已经被证明具有多种药理活性成分，具有特别的药用价值。从老蒜中分离提取出来的有机硫等一些具有活性的有效成分已经成为目前我国中药和西药研究的热点，其中SAMC(S-烯丙基巯基半胱氨酸)是一种微溶于水的有机硫化物，从蒜头中提取出来。大量文献研究表明，SAMC具有抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤、抑制粘液分泌、保肝、治疗顺铂所导致的肾损伤以及治疗急性肺损伤的作用。尽管SAMC具有较为良好的药用价值，但由于SAMC在水相和有机相的溶解度都较低，无法达到体内给药的有效剂量，SAMC的应用并没有得到有效广泛的发展。基于此，本实验课题拟通过制备SAMC的给药剂型从而提高SAMC的溶解度，达到体内外所需的给药水平，进而探究SAMC对于治疗糖尿病肾病所导致的肾纤维化作用的药效与相关分子生物学作用机制。
本课题研究的实验内容主要包罗下列三个部分:
(1)SAMC环糊精包合物(SAMC-β-CD)的制备与表征;
(2)SAMC体外抗肾纤维化作用及其相关分子生物学作用通路的探究;
(3)SAMC-β-CD体内对于糖尿病肾病引起的肾纤维化的治疗作用及作用机制的研究。
1、SAMC-β-CD的制备与表征:此项研究部分包括建立了SAMC原料药含量测定方法学的建立、筛选稳定剂、制备SAMC-β-CD的制备工艺、以包合率作为指标筛选最优良的处方、SAMC-β-CD包合物的表征以及溶解度实验验证包合作用对SAMC在水中溶解程度的影响;首先通过HPLC建立了SAMC的标准曲线并用于含量测定与后期的处方筛选;通过稳定剂筛选，实验结果显示PVP-K30是较为适宜的稳定剂，以β-环糊精作为包合材料和PVP-K30作为稳定剂对SAMC进行包合后，通过单因素筛选，进HPLC测定包合率的方法筛选出最优良的处方，实验结果表明β-环糊精与SAMC的最适宜比例为10∶1，SAMC-β-CD与PVP-K30的最佳比例为3∶1;SAMC-β-CD包合物形成的验证采取红外光谱分析方法(FT-IR)、差式扫描量热法(DSC)的表征方式;通过溶解度实验证明了SAMC原料药制备成SAMC-β-CD包合物能增加其溶解度。
2、SAMC体外抗肾纤维化作用及其相关分子生物学作用通路的探究:此项研究部分主要由体外肾纤维化模型的建立、测定细胞增殖蛋白的表达、分子信号通路的研究三个模块组成。实验方法主要是将大鼠肾系膜细胞(RMC)培养在高浓度的葡萄糖环境中，从而建立体外肾纤维化模型，观察肾纤维化细胞形态及MTT法对肾纤维化细胞活力进行测定，筛选出了最佳葡萄糖建模浓度为30mM，最适宜的SAMC给药浓度范围在5-100μM之间，进而选定10、25、50μM为低中高给药浓度;采用Westernblot法测定相关蛋白通路，以及纤连蛋白Fibronectin和增殖细胞核抗原PCNA的表达。实验结果显示出，经过SAMC的治疗，显著降低了纤连蛋白Fibronectin和增殖细胞核抗原PCNA的表达，而机制通路研究证明SAMC可以抑制RMC细胞的增殖，可以通过影响NF-κBp65机制通路来实现，说明SAMC在体外具有抗增殖及治疗肾纤维化作用。
3、SAMC-β-CD对于糖尿病肾病引起的肾纤维化的治疗作用及作用机制的研究:此项研究部分主要包括糖尿病肾病小鼠模型的建立、SAMC-β-CD对糖尿病肾病小鼠肾纤维化的治疗作用、肾脏病理组织切片检查、相关分子生物学作用机制的研究。在该临床实验中，将130mg/kg的链脲佐菌素(STZ)一次性大剂量地注射到模型小鼠的腹膜腔中，用于创建患有糖尿病性肾病的模型小鼠，注射建模药物72h后，对所有小鼠禁食不禁水8h，剪尾法检测空腹血糖，选择空腹血糖≥11.0mmol/L的小鼠进行分组;每间隔一周检查一次体重和空腹血糖。同时SAMC-β-CD(50、100 mg/kg)灌胃干预8周，依那普利(1.5 mg/kg)作为阳性药。第7周，收集一个24h小鼠尿液被应用于计算和测定一个小鼠尿中微量白蛋白水平;8周后处死小鼠，心脏灌流后收集左肾以左叶片染色时可用于观察小鼠的形态学改变、系膜扩张、细胞外基质沉积以及糖原累计情况;收集一只小鼠的血清，进行体内肾功能参数的测定;通过Westernblot方法探索其中有关的分子生物学反应机制。研究结果表明，给予SAMC-β-CD后能明显改善肾系膜纤维化，从Masson染色结果观察到肾系膜扩张现象有所缓解，PAS染色结果显示SAMC-β-CD大大降低了葡萄糖原的累积;同时尿中微量白蛋白程度也有所减少，有效地缓解了白蛋白尿现象;肾功能参数血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)均可有所减少;总甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)的减少说明由于体内高血糖浓度超出了正常体内水平导致脂质代谢紊乱的情况已经有所改善;ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6的表达水平及其RT-PCR法测定炎症因子在基因水平的表达，发现SAMC-β-CD能在体内发挥抗炎症反应的作用;Westernblot测定结果表明，SAMC降低了细胞外基质标志蛋白fibronectin、collagen-Ⅰ、E-cadherin、vimentin的表达，进而显示SAMC抗肾纤维化的疗效与影响上皮-间质转分化(EMT)相关。从上游的信号通路途径来看，SAMC-β-CD一方面可以通过影响LRP5/6的表达从而影响Wnt3a/β-catenin信号通路，另一方面通过抑制NF-κBp65/HIF-1α上游传输通路，调控下游的转录因子Snail影响EMT的过程主要是通过两条信号通路共同作用。
综上所述，本实验课题为了增加SAMC在水中的溶解度达到体内所需的给药剂量，设计制备了SAMC-β-CD，筛选出最佳工艺处方并对制剂进行了表征。采用葡萄糖刺激，建立了体外肾纤维化模型，考察验证了SAMC对于抗细胞增殖治疗肾纤维化的作用效果及其作用机制。使用STZ建立体内糖尿病肾病模型，证明SAMC-β-CD可以有效缓解糖尿病肾病所引起的肾纤维化和炎症反应，其作用机制主要是通过降低LRP5/6的表达抑制Wnt3a/β-catenin途径的激活，同时抑制NF-κBp65/HIF-1α信号通路的激活，两条信号途径共同调控EMT进程降低ECM积累，抑制STZ所导致的糖尿病肾病而引起的肾脏纤维化。