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目的:卵巢癌是妇科最常见的致死性肿瘤,五年生存率仅30%左右。虽然卵巢癌对铂制剂等一线化疗药物有较好的应答,然而高复发率和耐药性严重限制了化疗效果,肿瘤干细胞很可能在其中起到了关键作用。因此,我们从卵巢浆液性腺癌患者腹水中分离卵巢癌细胞并建系,建立成熟的卵巢癌侧群细胞分离方法,对侧群细胞进行鉴定和生物学特性研究;比较侧群细胞与非侧群细胞的转录组差异,并对差异基因进行富集分析,为研究卵巢癌干细胞调控肿瘤发生、发展、转移和耐药确立研究方向,并为新的治疗策略提供理论支撑。方法:1.人腹水来源卵巢癌永生化细胞系的建立及其生物学特性研究。采集卵巢浆液性腺癌(stage IIIc,grade 3)患者腹水,分离纯化出其中的卵巢癌细胞,并进行传代培养;观察此细胞系中卵巢癌细胞的生长状态和显微及超微结构;测定卵巢癌细胞的生长曲线,并对其进行染色体核型分析;最后,将卵巢癌细胞接种于NOD-SCID小鼠皮下检测其成瘤性,并对移植瘤进行组织学及免疫组化鉴定。2.人腹水来源卵巢癌细胞系中侧群细胞的分离及鉴定。Hoechst33342预染细胞后,以流式细胞术分选出侧群细胞和非侧群细胞,分别培养于无血清、含血清及软琼脂培养基中,比较两类细胞的自我更新、分化和克隆形成能力;通过免疫细胞化学染色比较两类细胞肿瘤干细胞标记物及干性基因表达差异;再将这两类细胞分别皮下或腹腔注射于NOD-SCID小鼠,比较其成瘤能力的差别,并对移植瘤进行组织学及免疫组化鉴定。3.人腹水来源卵巢癌细胞系中侧群细胞的生物学特性研究。采用划痕和Boydon小室实验检测两者的迁移和侵袭能力;对顺铂的耐药性则由侧群和非侧群细胞在一系列药物浓度下细胞生存率进行评估。4.人腹水来源卵巢癌细胞系中侧群细胞差异表达基因检测与富集分析。应用全基因组芯片检测技术筛选侧群细胞的差异表达基因,对差异基因分别进行GO分析、KEGG pathway分析和PPI分析,并对差异基因进行q PCR验证。结果:1.人腹水来源卵巢癌永生化细胞系的建立及其生物学特性研究。通过分离、纯化和传代培养,成功地由卵巢浆液性腺癌患者腹水的脱落细胞建立了卵巢癌细胞系OVA-W,目前已历经70代,具有永生化特征;该卵巢癌细胞贴壁生长,无接触性抑制,具有细胞异型性、核浆比例增加、核仁增大、细胞器增多等肿瘤细胞结构特征;卵巢癌细胞呈指数生长,群体倍增时间为31.2h,染色体核型均为超二倍体,可见染色体结构异常及衍生染色体;NOD-SCID小鼠移植瘤为卵巢低分化浆液性腺癌,与原发肿瘤无组织学差异,并表达卵巢浆液性腺癌标记物CA125及CK7。2.人腹水来源卵巢癌细胞系中侧群细胞的分离及鉴定。通过荧光标记流式细胞术由此卵巢癌细胞系中分离出的侧群细胞比例为(0.38±0.05)%。在体外实验中,侧群细胞与非侧群细胞经分化培养,前者侧群细胞的比例明显高于后者;经无血清悬浮培养,前者的成球数量显著高于后者;经软琼脂克隆培养,前者克隆形成率也明显高于后者;经免疫细胞化学染色,侧群细胞较非侧群细胞高表达肿瘤干细胞标记物CD133、ALDH及干性基因Nanog;在体内实验中,仅少量侧群细胞(1.0×103)接种于NOD-SCID小鼠皮下及腹腔即可成瘤,瘤组织在组织学特征上与原代肿瘤组织一致,并且表达卵巢浆液性腺癌的分子标志CA125。3.人腹水来源卵巢癌细胞系中侧群细胞的生物学特性研究。划痕实验结果显示侧群细胞较非侧群细胞迁移率高;Boydon小室实验结果显示侧群细胞较非侧群细胞具有更强的侵袭能力;对顺铂的耐药实验中,侧群细胞的IC50值明显高于非侧群细胞及未分选细胞,顺铂可使卵巢癌细胞中的侧群细胞比例显著上升,另外加入维拉帕米后,经顺铂处理的侧群细胞细胞生存率显著下降。4.人腹水来源卵巢癌细胞系中侧群细胞差异表达基因检测与富集分析。通过对侧群与非侧群细胞的全基因组芯片检测,筛选出2倍以上差异表达基因共21个,其中18个基因表达上调,3个基因表达下调;对这些差异表达基因进行富集分析显示TNFAIP3、IL-6和CXCL8基因可能与侧群细胞的特性相关;q PCR结果验证了这些差异基因在侧群细胞中高表达。结论:1.本研究由一高级别晚期卵巢浆液性乳头状囊腺癌患者腹水建立了一个永生化卵巢癌细胞系,经鉴定具有由其分离的肿瘤特征。2.由该细胞系可稳定、持续分离出一个极低比例的侧群细胞亚群,经鉴定该细胞亚群具有自我更新和分化潜能,可高表达肿瘤干细胞标记物及干性基因,以及较强的克隆形成能力和再现原发肿瘤表型的特点,符合肿瘤干细胞的基本特征,可做为卵巢癌干细胞生物学特性研究的细胞模型。3.该细胞系的侧群细胞表现为较强的迁移和侵袭和能力;对卵巢癌一线化疗药物顺铂耐药,且ABC结合盒转运蛋白与其耐药相关。4.根据侧群细胞差异表达基因的富集分析结果,推测TNFAIP3、IL-6和CXCL8基因可能与侧群细胞的肿瘤干细胞特性相关。本研究为卵巢癌干细胞调控肿瘤进展及耐药的分子机制提供了研究思路,并为卵巢癌的特异性治疗提供了可靠的靶点。