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紫花苜蓿是一种多年生牧草,在畜牧业中发挥着越来越重要的作用,其使用量逐年增加,被誉为“牧草之王”。秋眠性是紫花苜蓿在夏末、秋季所表现出来的植株生长速率下降、茎枝匍匐生长的一种特性,是影响苜蓿产量和适应性的关键因子,也是区域种植苜蓿选择品种的重要依据,然而,至今调控苜蓿秋眠性的分子机制仍不清楚,本研究的目的主要是筛选与确定调控苜蓿秋眠性的关键基因和蛋白,以揭示其调控机理。首先,本研究通过比较国际上苜蓿标准对照品种Maverick(秋眠型苜蓿)和CUF101(非秋眠型苜蓿)在秋眠和非秋眠季节叶片的转录组来筛选其差异基因,并通过荧光定量技术确定了差异基因单半乳糖甘油二酯合成酶、类IAA-氨基酸水解酶ILR1的m RNA含量与日照长度显著正相关,细胞周期蛋白D5-2含量与日照长度显著负相关;Rubisco活化酶与温度显著正相关,脱落酸受体PYL8含量与温度显著负相关。另外根据差异基因中未知基因的差异倍数、序列可翻译的长度和完整性筛选出了10个未知基因并应用RACE法对其进行了克隆,最终得到71142、32802和59277等3个未知基因的m RNA和DNA,分析了其外显子、内含子和CDS,并且预测其蛋白大小等。其次,应用以i TRAQ技术为基础的蛋白质组分析技术得到了秋眠时Maverick和CUF101顶芽蛋白质组和二者间的90个差异蛋白,并采用GO和KEGG对其功能进行了分析聚类,显示这些差异蛋白主要参与了氨基酸和蛋白质的代谢、生长素的极性转运、水溶性维生素的代谢等,以及苯丙氨素的合成途径、植物的昼夜节律途径、黄酮合成途径等;然后应用荧光定量技术检测了差异蛋白中16个重要蛋白在秋眠前后生长周期中的m RNA含量变化,从而初步确定顶芽中L-天冬酰胺酶、噻唑生物合成酶,醛酮还原酶家族氧化还原酶,肉桂醇脱氢酶蛋白含量的减少诱导了Maverick的秋眠;查尔酮和芪合酶家族蛋白水平的增加促进了CUF101在秋季的生长,糖苷水解酶家族1蛋白的增加增强了CUF101在秋季的抗性和促进了生长;另外根据蛋白在两个苜蓿品种顶芽中的有无和荧光定量的检测确定了RBP47C蛋白在秋眠时Maverick顶芽中特异性的高表达,推测其也很可能参与了苜蓿的秋眠。叶片转录组和顶芽蛋白质组的联合分析确定了一个新蛋白(MSTPR)的存在。从叶片转录组和顶芽蛋白质组测序的结果中筛选出了SPL1(Squamosa启动子结合蛋白1)、RBP47C(多聚腺苷酸结合蛋白RBP47C)和L-天冬酰胺酶等3个已知基因(蛋白)和71142、32802和MSTPR等3个未知基因,应用转基因技术进一步验证和研究它们在苜蓿秋眠性中的功能。结果:目前只有SPL1在WL903(非秋眠型苜蓿)和32802在驯鹿(秋眠型苜蓿)过表达后其阳性转基因植株的表型有明显变化:相对于阴性转基因植株和野生型植株,过表达SPL1的WL-903品种生长变慢、茎变细,在春季的生长与野生型WL903无明显差异;过表达32802的驯鹿品种表现出快速生长、茎变粗的特征,推测SPL1表达量增加和32802表达量减少导致了苜蓿的秋眠;同时应用pull-down技术筛选了SPL1调控靶基因。此外,应用原核表达系统成功表达纯化了SPL1、RBP47C和L-天冬酰胺酶3个已知基因(蛋白)和71142、32802和MSTPR等6个蛋白,并免疫小白鼠制备了它们的多克隆抗体,为检测秋眠型和非秋眠型苜蓿中6个蛋白的含量以及更深入的功能研究提供了基础。