研究背景:糖尿病及其并发症的流行对全球健康构成严重威胁。全球约4.25亿成年人患有糖尿病,其中超过90%是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)。因此,研究糖尿病的发病机制、寻找有效的糖尿病控制方法仍然是目前糖尿病相关研究的重点。肝脏是机体胰岛素和能量代谢调控的主要靶器官之一,它通过控制糖异生及糖原分解过程控制着肝葡萄糖释放水平,并以此方式在维持血浆葡萄糖稳态中发挥重要作用。肝脏糖异生紊乱引起葡萄糖输出异常增加是T2DM重要的病理基础之一。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指长度在200个碱基对以上但是不具备蛋白质编码功能的RNA。LncRNA在细胞代谢中主要起调节作用,其发现为研究糖尿病的分子机制开辟了新领域。研究显示lncRNA参与了很多调控糖尿病病理生理的过程,包括影响胰岛功能、调节肝脏代谢、在脂肪组织中调节糖代谢及分化等等,但lncRNA在糖尿病中的相关研究仍然没有得到充分重视,目前为止只有少量lncRNA在糖尿病中的异常表达被检测出来,并且仅有更少的lncRNA在糖尿病发展中的作用得到探究。因此,探讨lncRNA与糖尿病发生、发展相关性是一项很有价值的工作。母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)的表达异常在T2DM发生发展中发挥了重要作用。我们的前期研究结果显示,lncRNA MEG3通过增加糖代谢的重要转录因子叉头框蛋白01(forkhead box protein 01,FoxO1)及下游基因葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6pc)及磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)的表达促进肝脏胰岛素抵抗。但目前尚不清楚MEG3促进糖异生的具体分子机制。因此在本论文中,我们进一步探究了糖异生过程中MEG3对Fox01/PEPCK/G6pc信号途径的调控机制。此外,磷酸化的环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子(peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC-1α),活化的PGC-1α激活PEPCK和G6pc的转录,增强糖异生作用。基于此,我们还研究了MEG3调控PGC-1α/PEPCK/G6pc信号途径的分子机制。本论文拟探讨MEG3对肝脏糖异生的调控作用及机制,丰富了肝脏胰岛素抵抗的分子病理机制,并为探索防治肝脏胰岛素抵抗的有效靶点提供了理论依据。第一部分LncRNAMEG3通过充当miR-214的竞争性内源RNA上调ATF4的表达,促进肝脏胰岛素抵抗一、研究目的:很多研究表明lncRNA可充当某些miRNA的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)来抑制miRNA对其靶基因的靶向抑制作用。我们的前期研究显示MEG3能够上调FoxO1及其下游的糖异生关键酶PEPCK和G6pc的活性从而促进肝脏糖异生。已有研究表明激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)可促进FoxO1的转录活性从而促进糖异生。生物信息学分析发现miR-214和MEG3的部分序列互补,且ATF4是miR-214潜在的靶基因。因此,我们做出以下科学假设:MEG3作为miR-214的ceRNA可促进ATF4的表达,上调了FoxO1及其下游PEPCK和G6pc的表达,从而增加肝脏糖异生和促进胰岛素抵抗。二、研究方法:雄性C57BL/6小鼠喂食高脂饮食(high-fat diet,HFD)或低脂饮食(low-fat diet,LFD),诱导胰岛素抵抗。采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分别检测小鼠肝组织或原代小鼠肝细胞中MEG3、miR-214、ATF4、FoxO1、PEPCK和G6pc的表达,采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测小鼠肝组织和小鼠原代肝细胞中ATF4、FoxO1、PEPCK、G6pc 的蛋白水平。通过转染小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)、pcDNA3.1质粒、抑制物(inhibitor)或模拟物(mimic),进一步探讨MEG3与miR-214和ATF4之间的调控机制。荧光素酶报告系统检测MEG3与miR-214,miR-214与ATF4之间的靶向关系。对HFD小鼠尾静脉注射慢病毒介导的特异性抑制MEG3的si-MEG3,分析lncRNAMEG3是否通过靶向miR-214,解除了其对ATF4的抑制作用,从而促进了 FoxO1及其下游基因的表达。三、研究结果:1.HFD喂养小鼠和棕榈酸酯刺激的肝细胞中的MEG3和ATF4的表达水平上调,而miR-214的表达下调2.MEG3作为ceRNA结合miR-214以上调ATF4的表达过表达MEG3和抑制miR-214可上调MEG3的表达水平,下调miR-214的水平,上调ATF4的信使RNA(message RNA,mRNA)和蛋白水平。相反,敲低MEG3和过表达miR-214可下调MEG3的表达水平,上调miR-214水平而下调ATF4的mRNA和蛋白水平。MiR-214 mimic对ATF4表达的下调作用可被MEG3过表达所减弱,且MEG3对ATF4表达的上调作用可被miR-214 mimic所减弱。荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-214 mimic显著降低MEG3-野生型(wild-type,Wt)组中荧光素酶活性,而对MEG3-突变型(mutated,Mut)组中的荧光素酶活性没有明显影响,这证实了 MEG3和miR-214之间的直接结合。此外,miR-214 mimic也可显著降低ATF4-Wt组中荧光素酶活性,而对ATF4-Mut组中的荧光素酶活性没有明显影响,这表明ATF4是miR-214的靶基因。以上结果表明MEG3可作为miR-214的ceRNA结合miR-214以上调ATF4的表达。3.敲低MEG3可下调FoxO1和FoxO1下游基因PEPCK和G6pc的mRNA和蛋白水平,而这个效果可被miR-214抑制剂和ATF4过表达减弱。4.在HFD小鼠中,MEG3 的体内干扰可明显抑制小鼠的肝甘油三酯(triglyceride,TG)积累,并显著恢复小鼠的肝脏糖原水平。此外,MEG3的干扰可改善HFD小鼠的空腹血糖水平和糖耐量受损,并改善小鼠的胰岛素耐受性。同时,MEG3的体内干扰可上调小鼠肝组织中miR-214的表达,但下调ATF4的表达。四、研究结论:MEG3通过靶向miR-214,解除了其对ATF4的抑制作用,从而促进了 FoxO1及其下游基因PEPCK和G6pc的表达,促进肝胰岛素抵抗,参与糖尿病的发生。第二部分CREB上调的lncRNAMEG3通过调节miR-302a-3p-CRTC2轴促进肝脏糖异生一、研究目的:胰高血糖素刺激蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活化,从而激活转录因子 cAMP 效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)并使其磷酸化,磷酸化的CREB激活PGC-1α,活化的PGC-1α激活PEPCK和G6pc的转录,增强糖异生作用。CREB调节转录因子2(CREB-regulated transcription coactivator 2,CRTC2)属于CRTC家族,可与CREB的碱性亮氨酸拉链结构结合以调节CREB转录因子活性。有研究表明CREB能够与MEG3基因启动子上的cAMP反应元件结合,促进MEG3的表达。生物信息学分析结果表明,miR-302a-3p和MEG3的部分序列互补,且CRTC2是miR-302a-3p潜在的靶基因。因此我们推测在肝脏糖异生过程中,CREB与MEG3的启动子结合促进MEG3的转录,而MEG3作为ceRNA竞争性结合miR-302a-3p,从而促进miR-302a-3p靶基因CRTC2的表达。二、研究方法:我们在从C57BL/6J小鼠分离的原代肝细胞中模拟肝脏糖异生病理状态,将小鼠原代肝细胞分为四组:胰高血糖素诱导组、胰高血糖素诱导+PKA抑制剂(H89)组、胰高血糖素诱导+CREB特异性抑制剂磷酸萘酚AS-E(2-naphthol AS-E phosphate,KG-501)组以及对照组。合成 CREB 小干扰 RNA(si-CREB)、MEG3小干扰 RNA(si-MEG3)、PGC-1α 小干扰 RNA(si-PGC-1 α)、CRTC2 小干扰 RNA(si-CRTC2)、CREB 过表达载体(CREB)、MEG3 过表达载体(MEG3)、CRTC2过表达载体(CRTC2)、miR-302a-3p mimic 以及 miR-302a-3p inhibitor,转染入小鼠原代肝细胞。通过qRT-PCR和Western blot法测定MEG3、miR-302a-3p、CRTC2、PKA、CREB、PGC-1α、PEPCK和G6pc的表达水平。通过荧光素酶报告实验明确MEG3、miR-302a-3p和CRTC2之间的关联。三、研究结果:1.MEG3在胰高血糖素诱导的小鼠原代肝细胞中表达上调2.胰高血糖素刺激PKA活化,从而激活CREB,CREB与MEG3的启动子结合促进MEG3的转录胰高血糖素时间依赖性地上调p-PKA和p-CREB蛋白水平,并降低肝细胞活力。H89和KG-501能有效抑制胰高血糖素诱导的MEG3表达水平的升高。敲低CREB后显著降低CREB和MEG3的表达,而CREB过表达导致相反效果。荧光素酶报告基因实验结果表明野生型质粒能促进MEG3启动子活性。qRT-PCR检测结果表明敲低CREB降低了 MEG3在胰高血糖素诱导的肝细胞中的表达水平。3.CREB上调的MEG3调控肝脏糖异生中PGC-1α/PEPCK/G6pc信号途径敲低MEG3可降低胰高血糖素诱导的小鼠原代肝细胞中的糖异生基因PGC-1α、PEPCK和G6pc的蛋白水平,而MEG3过表达增加PGC-1α、PEPCK和G6pc的蛋白水平。而用PKA抑制剂H89和CREB抑制剂KG-501处理,敲低CREB和PGC-1α均可显著降低MEG3过表达诱导的这些糖异生基因的蛋白水平。4.MEG3 作为 ceRNA 结合 miR-302a-3p 上调 CRTC2 表达胰高血糖素诱导时间依赖性地上调小鼠原代肝细胞中CRTC2的蛋白水平并下调miR-302a-3p的表达。荧光素酶实验结果表明miR-302a-3pmimic显著降低MEG3-Wt组中荧光素酶活性,而对MEG3-Mut组中的荧光素酶活性没有明显影响,这证实了 MEG3和miR-302a-3p之间的直接结合。此外,miR-302a-3p mimic也可显著降低CRTC2-Wt组中荧光素酶活性,而对CRTC2-Mut组中的荧光素酶活性没有明显影响,这表明CRTC2是miR-302a-3p的靶基因。此外,MEG3过表达下调miR-302a-3p表达,上调CRTC2的mRNA和蛋白水平,相反,敲低MEG3产生相反结果。MiR-302a-3p mimic上调miR-302a-3p的表达,但下调MEG3和CRTC2的表达。miR-302a-3p抑制剂则产生相反结果。MEG3过表达不仅减弱了 miR-302a-3p mimic对CRTC2的靶向抑制作用,还减弱了 si-CRTC2对CRTC2的敲低作用。5.MEG3 通过 miR-302a-3p/CRTC2 轴调控肝脏糖异生中 PGC-1α/PEPCK/G6pc信号途径MiR-302a-3p mimic和si-CRTC2减弱了胰高血糖素对小鼠原代肝细胞中PGC-1α、PEPCK和G6pc蛋白水平的诱导作用,而MEG3过表达减弱了miR-302a-3p mimic 和 si-CRTC2 的效果。四、研究结论:胰高血糖素刺激PKA活化,从而激活CREB,CREB与MEG3的启动子结合促进MEG3的转录,而MEG3作为ceRNA结合miR-302a-3p,从而促进miR-302a-3p靶基因CRTC2的表达,从而激活PGC-1 α-PEPCK/G6pc通路,增强糖异生作用。