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目的:肾脏纤维化是慢性肾脏病最后共同的病理生理学过程,其具体发生机制仍不明确。本研究主要探讨细胞极性相关分子lethal giant larvae 1（Lgl1）对于肾脏纤维化的作用及其可能机制,以期为临床慢性肾脏病的治疗提供新的思路。方法:通过Ksp-cre和Lgl1-loxp杂交得到特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1的小鼠（Ksp-Lgl1-/-）,构建肾脏单侧缺血再灌注损伤（unilateral ischemia reperfusion injury,UIRI）模型模拟肾脏损伤后慢性化改变,观察野生型（wild-type,WT）和Ksp-Lgl1-/-小鼠间肾脏纤维化程度的差异。体外实验中,我们利用小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）沉默小鼠近端肾小管上皮细胞系TKPTS中Lgl1蛋白的表达,通过给予TGF-β1（10 ng/ml）或LPS（5μg/ml）刺激以探究可能的分子机制。结果:特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1后明显缓解了缺血再灌注小鼠模型中肾脏损伤,表现为间质纤维化的减轻、免疫及炎症细胞浸润的减少和肾脏细胞因子m RNA表达量的下降,并且这种效应不依赖于肾小管上皮细胞极性和增殖的改变。体外实验中,LPS刺激后,Lgl1与高迁移组蛋白1（high mobility group box1,HMGB1）在肾小管上皮细胞中存在共表达。沉默TKPTS细胞Lgl1抑制了HMGB1的乙酰化及后续的核质迁移和分泌,同时上调了去乙酰化酶sirtuin 1（SIRT1）的表达。应用SIRT1特异性抑制剂selisistat（EX527,10μM）后乙酰化HMGB1增加。体外构建乙酰化反应体系后进行液相色谱-质谱分析得到HMGB1潜在的5个赖氨酸乙酰化位点。结论:敲除肾小管上皮细胞中Lgl1可以通过上调SIRT1表达,减少HMGB1乙酰化后的迁移和分泌,减轻炎症反应,从而改善肾脏纤维化。第一部分:特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1缓解缺血再灌注小鼠模型肾脏纤维化目的:Lgl1作为细胞极性相关分子在肾间质纤维化中的作用暂未明确。本部分主要探讨特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1后对肾脏纤维化的影响。方法:通过Ksp-cre与Lgl1-loxp杂交手段获得特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1的基因小鼠（Ksp-Lgl1-/-）,选择8周龄小鼠构建缺血再灌注模型,28天后处死小鼠。通过Masson染色、天狼星红（Sirius red）染色观察野生型（WT）和KspLgl1-/-小鼠肾脏间质纤维化改变;利用免疫荧光和免疫印迹（Western blotting）法检测细胞外基质纤连蛋白（fibronectin,FN）、I型胶原蛋白（collagen I,COL I）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的沉积情况。结果:肾脏缺血再灌注损伤后,Masson及Sirius red染色结果显示,与野生型（WT）小鼠相比,特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1显著改善肾间质纤维化;免疫荧光和免疫印迹实验表明特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1明显减轻肾脏细胞外基质FN、COL I、α-SMA的沉积。结论:特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1缓解缺血再灌注小鼠模型肾脏纤维化。第二部分:特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1通过抑制免疫炎症反应改善肾脏纤维化目的:慢性持续性炎症反应对肾脏疾病的发生发展至关重要,抑制炎症反应可有效改善肾脏纤维化。Lgl1作为细胞极性调控分子可通过影响细胞极性和增殖活性参与许多病理生理过程。本部分拟探究Lgl1对肾脏纤维化的作用是否与炎症反应、细胞极性和增殖有关。方法:获得特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1的基因小鼠（Ksp-Lgl1-/-）后,构建缺血再灌注损伤模型,免疫组化染色法分别检测T细胞、树突状细胞、B细胞以及巨噬细胞标志物CD3、CD11c、CD19和F4/80在肾间质中浸润情况;实时定量PCR检测肾组织中各种细胞因子的m RNA表达量;分别通过免疫荧光和免疫组化方法检测上皮细胞极性指标E-cadherin和Occludin以及细胞增殖指标Ki-67在肾组织中的表达情况。体外实验中,si RNA抑制小鼠近端肾小管上皮细胞系TKPTS中Lgl1后给予TGF-β1（10 ng/ml）刺激一定时间,通过免疫印迹（Western blotting）方法检测E-cadherin和Occludin以及增殖指标PCNA的表达量;CCK8实验检测细胞增殖活力改变。结果:缺血再灌注损伤后,与野生型（WT）小鼠相比,Ksp-Lgl1-/-小鼠中肾脏T细胞、树突状细胞、B细胞以及巨噬细胞标志物CD3、CD11c、CD19和F4/80表达明显减少;细胞因子m RNA表达量下降。体内实验中,细胞极性指标E-cadherin、Occludin和细胞增殖指标Ki-67表达量在野生型（WT）和Ksp-Lgl1-/-小鼠中无统计学差异。体外实验中,在TGF-β1刺激下,抑制TKPTS细胞中Lgl1表达后,E-cadherin、Occludin以及PCNA的表达量在各实验组之间无明显改变。结论:特异性敲除肾小管上皮细胞Lgl1通过抑制免疫炎症反应改善肾脏纤维化,这种效应并不依赖细胞极性和增殖的改变。第三部分:SIRT1抑制HMGB1乙酰化及其迁移分泌,参与Lgl1调控肾脏纤维化的过程目的:HMGB1作为一类损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs）与炎症因子水平和疾病的严重程度密切相关。在本部分中,我们主要探讨Lgl1对肾脏纤维化的调控作用是否与HMGB1有关及可能的分子机制。方法:体外实验中,在LPS（5μg/ml）刺激下,利用免疫荧光和免疫共沉淀方法检测Lgl1和HMGB1在肾小管上皮细胞中是否存在共定位;沉默肾小管上皮细胞Lgl1后,免疫荧光及免疫印迹法检测HMGB1的核质迁移情况;利用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清中HMGB1分泌量;免疫印迹法检测乙酰化HMGB1及去乙酰化酶SIRT1的表达情况;应用SIRT1特异性抑制剂EX527后,免疫印迹法检测乙酰化HMGB1的改变情况。体内实验中,利用免疫组化染色观察野生型（WT）和Ksp-Lgl1-/-小鼠在缺血再灌注损伤模型中,肾脏HMGB1的分布迁移情况。最后,体外构建乙酰化反应体系,利用液相色谱-质谱分析法初步探讨HMGB1乙酰化可能的赖氨酸位点。结果:LPS刺激后,Lgl1和HMGB1在肾小管上皮细胞中存在共定位,且乙酰化HMGB1及其迁移分泌量均明显增加。沉默肾小管上皮细胞Lgl1后,SIRT1表达增加,HMGB1的乙酰化及迁移分泌过程受到抑制;SIRT1的抑制剂EX527的应用上调了乙酰化HMGB1比例。缺血再灌注损伤后,与野生型（WT）小鼠比较,Ksp-Lgl1-/-小鼠肾脏中SIRT1表达增加,HMGB1的核质迁移减少。质谱分析初步筛选出5个潜在的HMGB1乙酰化赖氨酸位点。结论:SIRT1抑制HMGB1乙酰化及迁移分泌,参与Lgl1调控肾脏纤维化的过程。