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GDP-岩藻糖,即二磷酸鸟苷岩藻糖,是一种核苷酸糖,作为糖基供体和代谢中间体广泛存在于各类生物中。在真核生物体内,它主要作为蛋白质糖基化的重要糖基供体和合成其他糖核苷酸的前体,为岩藻糖基化反应中提供岩藻糖基,是生命代谢调节过程中不可或缺的重要物质;在工业生产中,GDP-岩藻糖作为合成人乳寡糖的重要中间产物,在人乳寡糖的合成中具有重要的作用,拥有广阔的市场发展前景。因此,合成GDP-岩藻糖具有重要理论意义和实际应用价值。本论文的主要研究结果如下:1.本研究从大肠杆菌K-12基因组中克隆得到GDP-岩藻糖合成相关酶基因manB,从大肠杆菌BL-21（DE3）基因组中克隆得到GDP-岩藻糖合成相关酶基因manC、gmd、fcl,分别将基因与pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-6P-1、pGEX-6P-1载体连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL-21（DE3）中获得重组菌株。重组菌株在25oC下0.1 mM IPTG诱导24 h,可实现重组蛋白的可溶性表达。破碎后的粗酶液经过GST-Sefinose Resin亲和层析纯化,得到纯度较高的GDP-岩藻糖合成相关重组酶。质谱检测酶转化底物结果显示,manB-pGEX-4T-1不能将底物转化为产物,其余3种蛋白纯化效率较低,分别为1.0%,1.6%,5.17%,因此,需要高效表达并纯化GDP-岩藻糖合成相关重组蛋白。2.成功构建manB-pET-28a-BL21（DE3）、manC-pET-28a-BL21（DE3）、gmd-pET-28a-BL21（DE3）和fcl-pET-28a-BL21（DE3）重组工程菌株。mpglk-pET-28a-BL21（DE3）由苏州弘讯生物科技有限公司全序列合成,经过IPTG诱导后均实现了蛋白的可溶性表达。对GDP-岩藻糖合成相关酶的产量从载体、培养基、IPTG诱导浓度和诱导时间4个方面进行了优化。通过对TB培养基和LB培养基的对比,选择TB培养基为重组菌株的生长提供营养成分。通过对IPTG诱导浓度和诱导时间优化,分别得到了最佳的蛋白表达条件,mpglk为0.02 mM、48 h,manB为0.08 mM、48 h,manC为0.04 mM、36 h,gmd为0 mM、36 h,fcl为0.08 mM、36 h。最终优化后5种GDP-岩藻糖合成相关酶的产量分别是未优化的1.58、2.27、3.31、3.80和3.79倍。3.对GDP-岩藻糖合成过程中间产物甘露糖-6-磷酸的合成进行了优化,确定了合成甘露糖-6-磷酸的最佳反应条件:5 mM甘露糖,10 mM六偏磷酸钠,5 mM MgCl2,0.5mg/mL mpglk,100μL PBS缓冲体系,37oC反应8 h。甘露糖-6-磷酸的产率达到80%。简化了第三步中间产物GDP-甘露糖的合成步骤,即同时在反应体系中加入底物甘露糖和mpglk、manB、manC,37oC反应12 h,可生成GDP-甘露糖;比较并优化了三种GDP-岩藻糖的合成路线,得到产率最高的合成路径。即同时在反应体系中加入底物甘露糖、磷酸供体GTP、mpglk、manB和manC,反应12 h,加入gmd 37oC反应2 h,最后加入fcl 37oC反应2 h,GDP-岩藻糖达到最高转化率1.50%。