绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）可引起绵羊及山羊发生非典型肺炎。临床上以咳嗽、流鼻涕、渐进性消瘦和增生性间质性肺炎为主要特征。目前该病呈全球范围内流行，给养羊业生产造成了巨大的经济损失。在国内，胡景韶等(1982)首次从发病绵羊上分离到,随后甘肃、辽宁、四川、云南、江苏、新疆等地都有关于该病的报道,是严重威胁我国养羊业的重要病原之一。HSP70蛋白在支原体中是最保守的，具有分子伴侣和免疫佐剂效应，基于HSP70还可以清晰地划分支原体，将不同的支原体鉴别开来，因此是进行系统发育分析的有效靶标。基于HSP70与16S rRNA分别进行系统进化发育分析的结果具有重要的不同，可以提供不同的信息。因此，选择HSP70作为分子靶标，分析物种的遗传进化关系具有重要意义。虽然HSP70在物种内保守，但是也仍然存在遗传多样性。目前，尽管有绵羊肺炎支原体全基因组信息和绵羊肺炎支原体参考菌株Y98株HSP70基因序列的信息，但是对绵羊肺炎支原体临床分离株HSP70基因的遗传多样性还未有相关报道。本试验旨在分析绵羊肺炎支原体HSP70的遗传多样性以及更加全面地总结该蛋白的分子特征，并应用在分子检测中。1绵羊肺炎支原体HSP70基因遗传多样性的研究对14株绵羊肺炎支原体临床分离株和参考菌株Y98株HSP70基因的开放阅读框进行克隆测序。结果表明，Y98株HSP70基因开放阅读框长度为1815bp，编码604个氨基酸；14株绵羊肺炎支原体临床分离株HSP70基因开放阅读框长度为1818bp，编码605个氨基酸。所有临床分离株与参考菌株Y98相比，均在593位点插入Gln（谷氨酰胺）。临床分离株与参考菌株之间已经发生了遗传变异，这提示对遗传多样性进行研究具有生物学意义。对14株临床分离株和参考菌株Y98进行生物信息学分析，结果表明，HSP70基因的GC平均含量为34.16%，核酸同源性为96.1%～100%，氨基酸同源性为97.7%～100%。该蛋白属于混合型蛋白，存在一个跨膜区、不含有信号肽。氨基酸序列位点33～144、198～347和467～600这三个区域富含抗原表位。有124个变化的核苷酸位点和19个变化的推导氨基酸位点，这些发生变异的位点无规则的分布在整个基因中，其中1～600bp范围内突变率为7%，601～1200bp范围内突变率为7.7%，1201～1818（1815）bp范围内突变率为5.8%。Y98具有10个功能结构位点，而临床分离株有11个功能位点，临床分离株在86-92位插入了一个酪氨酸激酶磷酸化位点。在1～300bp和1400～1818（1815）bp这两个区域内与其他支原体种间差异较大，但种内保守，这为分子诊断提供了参考。基于HSP70对2株绵羊肺炎支原体和其他14种支原体进行种间遗传进化关系分析，结果表明，绵羊肺炎支原体与猪肺炎支原体的遗传关系最近，与结膜炎支原体遗传关系较近，与能够感染羊的其他支原体遗传关系较远，与基于全基因组的进化关系一致。进一步以16S rRNA对这2株绵羊肺炎支原体和其他14种支原体建立系统进化树，通过比较发现，绵羊肺炎支原体与结膜炎支原体的亲源关系最近，与猪肺炎支原体有较大的遗传距离。这两个基因建立的系统进化树存在较大差异，为我们提供了不同的信息，这一结果与对Mycoplasma capricolum的研究结果是类似的。基于HSP70对14株绵羊肺炎支原体临床分离株和参考菌株Y98进行种内遗传进化关系分析，结果表明，14株临床分离株和Y98各单独聚为一支，14株临床分离株又分为两个亚支。有趣的是，在14株临床分离株中，所有来自于乐至羊场的5株聚在一个亚支Cluster1A，所有来自于自贡羊场的4株聚在一个亚支Cluster1B，而来自于简阳的5株分布在Cluster1A和Cluster1B这两个亚支中。从有限的样本数量来看，乐至和自贡羊场的菌株似乎有地域性的倾向，这有待进一步扩大样本数量去证实。2基于HSP70基因建立了检测绵羊肺炎支原体的PCR方法绵羊肺炎支原体核酸和蛋白质均具有高度的异质性，其GC含量较低、分布不均，并且有关绵羊肺炎支原体基因特征、遗传多样性的报道较少，这都给靶基因的选择和引物的设计带来困难。目前绵羊肺炎支原体的分子检测方法只有McAuli-ffe L根据16S rRNA建立的PCR方法的报道。本研究根据前期克隆测序15株绵羊肺炎支原体HSP70基因发现，127～261bp这段序列种内具有很好的保守性，并且种间特异性相对较好，因此选择该段区域作为靶点，设计了一对引物，扩增片段大小为135bp，成功建立了检测绵羊肺炎支原体的PCR方法。该方法对35株已知临床阳性样本的检出率为100%，对丝状支原体丝状亚种LC型Y-goat株、丝状支原体山羊亚种PG3株、牛支原体、无乳支原体、精氨酸支原体、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌013株、金黄色葡萄球菌SW07株、巴氏杆菌和沙门氏菌等无关病原不检出，证明有良好的特异性；灵敏性可以达到4.4×10-3ng/反应，比McAuliffe L建立的PCR方法高10倍。该方法的成功建立对绵羊肺炎支原体的诊断和综合防治具有重要意义。3基于HSP70基因建立了绵羊肺炎支原体实时荧光定量PCR方法本研究在成功建立绵羊肺炎支原体HSP70基因的PCR方法基础之上，进一步建立该基因的实时荧光定量PCR方法。我们分别从引物浓度、模板浓度、退火温度、和扩增循环数优化了该方法的反应体系和反应条件。HSP70基因实时荧光定量PCR产物只有1个特异峰，熔解温度为80.2℃±0.5℃，无非特异扩增和引物二聚体。建立的实时荧光定量PCR方法的线性范围在7×108～7×103拷贝/反应，相关系数为0.9985，扩增效率为103.51%，标准方程为y=-3.24x+27.24。最低检测限为7拷贝/反应。在优化的反应体系下该方法对35株绵羊肺炎支原体临床分离株的检出率为100%，对丝状支原体丝状亚种LC型Y-goat株、丝状支原体山羊亚种PG3株、牛支原体、无乳支原体、精氨酸支原体、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌013株和金黄色葡萄球菌SW07株等无关病原不检出，具有较好的特异性；灵敏性比McAuliffe L建立的PCR方法高106，比我们建立的普通PCR方法高105。该方法的建立提供了更高的灵敏性，并且还可以精确定量，为绵羊肺炎支原体的诊断提供了有价值的方法。