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大豆异黄酮(Soy isoflavones)是大豆等豆类植物在生长过程中形成的一类以3-苯并吡喃酮为母核的天然产物,具有抗癌、预防骨质疏松、降低心血管发病率等多种生理功能。摄入人或其他动物体内的大豆异黄酮将被肠道微生物菌群转化为各种不同产物,现有研究表明,大豆异黄酮微生物转化产物具有比大豆异黄酮更高、更广的生物学活性。大豆异黄酮属天然产物,然而大豆异黄酮微生物转化产物在自然界并不存在,只能通过人工化学合成,或者通过分离大豆异黄酮转化菌株,利用微生物转化进行生物合成。目前,国内外学者已报道20余株大豆异黄酮转化菌株,但所有转化菌株发挥转化功能均必须在严格厌氧条件下进行,而长期维持严格厌氧环境需要大量资金投入,因此,大豆异黄酮转化菌株的严格厌氧特性已成为该类菌株开发利用的“瓶颈”。
本实验室前期从公鸡新鲜粪样中分离得到一株严格厌氧爱格氏菌属菌株HAU-59s,该菌株在厌氧条件下既能将底物黄豆苷原(Daidzein)转化为雌马酚(Equol),又能将底物染料木素(Genistein)转化为5-羟基雌马酚(5-Hydroxy-equol)。为提高菌株的耐氧特性,本研究对分自鸡粪样的严格厌氧细菌HAU-59s进行了耐氧驯化尝试,并成功得到在有空气氧条件下能正常生长的突变株,并将该突变株命名为兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s。
与原出发菌株HAU-59s相比,兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s在菌体形态、生长特性、生理生化特性等诸多方面发生了明显改变。(1)在菌体形态上,由未驯化的细小短杆变为驯化后的长丝状;(2)在生长状态方面,兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s多聚集在试管底部生长,且菌体生长量显著增加;(3)在生理生化特性方面,菌株的过氧化氢酶、产氨、脲酶以及明胶液化试验等,均由未驯化时的阴性变为阳性,且驯化后得到的兼性厌氧突变株明显加强了对阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、果糖、低聚木糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、低聚异麦芽糖、棉籽糖等碳源的利用能力。
兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s虽能在有氧条件下生长,但在有氧条件下却并不表现大豆异黄酮转化活性,该兼性厌氧突变株在厌氧条件下对底物黄豆苷原和染料木素仍具有转化活性。该突变株能高效转化底物黄豆苷原的浓度为0.8mmoL/L,平均转化率为89.08%,平均产出率为53.80%。
与转化黄豆苷原能力不同的是,该兼性厌氧突变株在厌氧条件下能高效转化底物染料木素的浓度仅为0.2mmoL/L,平均转化率为82.61%。此外,本研究检测了兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s静息细胞体系的转化能力,发现4×静息细胞转化体系的转化效果最好,在厌氧条件下能高效转化底物黄豆苷原的最大浓度为1.0mmoL/L,平均转化率83.08%,平均产出率为65.00%。
通过对兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s进行耐氧机制研究,发现该兼性厌氧突变株可通过产生过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及NADH氧化酶(NOX)和NADH过氧化物酶(NPX)系等,将液体培养基中的活性氧转变为水;通过产生NO气体消耗培养基中的溶氧;通过在兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s的菌体外壁形成一层“保护膜”结构,有效阻挡氧气通过细胞壁进入菌体细胞,或通过菌体变为长丝而聚集在氧化-还原电位较低的试管底部,从而更加有利于菌体的生长。
本实验室前期从公鸡新鲜粪样中分离得到一株严格厌氧爱格氏菌属菌株HAU-59s,该菌株在厌氧条件下既能将底物黄豆苷原(Daidzein)转化为雌马酚(Equol),又能将底物染料木素(Genistein)转化为5-羟基雌马酚(5-Hydroxy-equol)。为提高菌株的耐氧特性,本研究对分自鸡粪样的严格厌氧细菌HAU-59s进行了耐氧驯化尝试,并成功得到在有空气氧条件下能正常生长的突变株,并将该突变株命名为兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s。
与原出发菌株HAU-59s相比,兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s在菌体形态、生长特性、生理生化特性等诸多方面发生了明显改变。(1)在菌体形态上,由未驯化的细小短杆变为驯化后的长丝状;(2)在生长状态方面,兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s多聚集在试管底部生长,且菌体生长量显著增加;(3)在生理生化特性方面,菌株的过氧化氢酶、产氨、脲酶以及明胶液化试验等,均由未驯化时的阴性变为阳性,且驯化后得到的兼性厌氧突变株明显加强了对阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、果糖、低聚木糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、低聚异麦芽糖、棉籽糖等碳源的利用能力。
兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s虽能在有氧条件下生长,但在有氧条件下却并不表现大豆异黄酮转化活性,该兼性厌氧突变株在厌氧条件下对底物黄豆苷原和染料木素仍具有转化活性。该突变株能高效转化底物黄豆苷原的浓度为0.8mmoL/L,平均转化率为89.08%,平均产出率为53.80%。
与转化黄豆苷原能力不同的是,该兼性厌氧突变株在厌氧条件下能高效转化底物染料木素的浓度仅为0.2mmoL/L,平均转化率为82.61%。此外,本研究检测了兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s静息细胞体系的转化能力,发现4×静息细胞转化体系的转化效果最好,在厌氧条件下能高效转化底物黄豆苷原的最大浓度为1.0mmoL/L,平均转化率83.08%,平均产出率为65.00%。
通过对兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s进行耐氧机制研究,发现该兼性厌氧突变株可通过产生过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及NADH氧化酶(NOX)和NADH过氧化物酶(NPX)系等,将液体培养基中的活性氧转变为水;通过产生NO气体消耗培养基中的溶氧;通过在兼性厌氧突变株Aeroto-HAU-59s的菌体外壁形成一层“保护膜”结构,有效阻挡氧气通过细胞壁进入菌体细胞,或通过菌体变为长丝而聚集在氧化-还原电位较低的试管底部,从而更加有利于菌体的生长。