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肿瘤的多药耐药(multidrug resistance, MDR)一直是导致肿瘤治疗失败的主要原因。MDR形成的机制很复杂,包含多种可能的作用途径与方式,主要包括依赖ATP外排泵的过度表达、降低药物吸收、解毒系统的激活或存活途径的改变。目前,临床上使用的多种逆转药物如维拉帕米、环孢霉素、三氟拉嗪等多因其严重的心、肝、肾毒性作用而使其临床应用受到限制。国内外学者正积极寻找作用靶点多、高效、低毒、逆转效果显著的肿瘤逆转剂。透明质酸(hyaluronic acid, HA)是由相同的二糖重复单元排列而形成的无支链的直链高聚物,HA的相对分子量(Mr)约为106～107Da,具有独特的粘弹性和生理功能,是细胞外基质的主要成分,具有保湿、润滑、调节渗透压等作用。HA可以保护正常的细胞免受细胞毒性的作用,但同时也可以促进肿瘤的侵袭、转移、增殖和MDR。HA经过降解可以得到HA寡糖(oligosaccharides of hyaluronic acid,o-HAs),Mr在1×104以下,其性质与普通HA大不相同,甚至具有完全相反的作用。研究表明,LMWHA (?)o-HAs具有抗氧化、调节免疫、抗炎、促进伤口愈合等活性。在逆转肿瘤MDR方面o-HAs和HA相比较具有明显的差异性,o-HAs可以增强耐药细胞对化疗药物的敏感性,抑制肿瘤MDR。本课题研究了酶解制备的单一聚合度的o-HAs,发挥逆转逆转肿瘤细胞的MDR作用的潜在机制。1单一聚合度o-HAs制备优化酶法降解HA的最适合反应条件为底物浓度为10g/L,酶浓度为1.5×106U/L,pH5.0,反应温度为50℃。采用Bio-gel P6和G-10进行分离纯化,并通过质谱分析确定制备样品为o-HA4、o-HA6、o-HA8三种寡糖。2o-HAs对肿瘤细胞耐药性的影响以MTT法检测ADR对细胞的生长抑制作用,计算耐药倍数,人慢性髓性原白血病细胞耐药株K562/A02耐药倍数为98.90,人乳腺癌耐药细胞MCF-7/Adr耐药倍数为166.03。同时以MTT法检测o-HAs对K562/A02和MCF-7/Adr生长活性的影响,确定了o-HAs对K562/A02及MCF-7/Adr细胞的无毒剂量,在浓度为200μg/mL时,对肿瘤细胞的抑制率仍低于20%。MTT法检测o-HAs与ADR联合使用时对K562/A02细胞及MCF-7/Adr细胞的生长抑制作用有所提高,o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,对K562/A02细胞逆转倍数分别为3.2429、31251和4.2807,对MCF-7/Adr细胞的逆转倍数为5.6172、9.1195和8.9066。利用自荧光测定方法测定细胞内ADR的蓄积,o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,K562/A02细胞内ADR的蓄积提高的倍数为2.8、2.95和3.08, MCF-7/Adr细胞内ADR的蓄积提高的倍数为2.13、2.23和2.32。利用自荧光测定方法测定细胞内罗丹明123的蓄积和外排,o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,K562/A02细胞内的罗丹明123的蓄积提高的倍数为2.34、2.45和2.46,MCF-7/Adr细胞内罗丹明123的蓄积提高的倍数3.31、3.47和3.01,且同时可以抑制罗丹明123的外排。3o-HAs逆转MDR的作用机制以荧光素-荧光素酶法分析K562/A02细胞及MCF-7/Adr细胞中的ATP含量,来考察o-HAs对P-gp能量依赖性的影响。o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,K562/A02细胞内ATP含量的降低率分别为29.76%、30.06%和32.60%,MCF-7/Adr细胞内ATP含量的降低率分别为48.08%、51.88%和51.07%。以无机磷释放法来检测o-HAs对P-gp ATPase活性的影响,o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,K562/A02细胞内P-gp ATPase提高的倍数为4.32、4.22和3.81,MCF-7/Adr细胞内P-gp ATPase提高的倍数为2.93、2.86和2.87。以非放射性方法检测o-HAs对K562/A02细胞及MCF-7/Adr细胞内PKC活性的影响,评价o-HAs对P-gp磷酸化水平的影响,o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,K562/A02细胞内PKC活性降低率为54.36%、54.17%和62.11%,MCF-7/Adr细胞内PKC活性降低率为58.86%、57.71%和59.125%。以Western blot法观察o-HAs对细胞P13K/Akt细胞存活途径中PTEN蛋白和Akt蛋白表达的影响,o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,K562/A02细胞内PTEN蛋白表达量提高的倍数为4.31、6.31和5.01,Akt蛋白表达抑制率分别为45.38%、51.84%和61.325%,MCF-7/Adr细胞内PTEN蛋白表达量提高的倍数为2.31、2.54和2.58,Akt蛋白表达抑制率分别为43.28%、56.04%和54.35%。利用RT-PCR方法观察o-HAs对K562/A02细胞及MCF-7/Adr细胞内MDRlmRNA的影响,o-HA4、o-HA6和o-HA8浓度在100μg/mL时,K562/A02细胞内MDR1mRNA表达水平下降率为13.49%、24.6%和27.78%,MCF-7/Adr细胞内MDR1mRNA表达水平下降率为22.23%、29.36%和33.78%。本研究取得的主要研究成果：1.确定了o-HAs具有良好的逆转肿瘤MDR的活性,可以明显增加ADR和Rh123的胞内蓄积量,同时有效抑制Rh123外排。2.确定了o-HAs可不同程度的降低肿瘤细胞ATP水平,提高P-gp ATPase活性,并对肿瘤细胞内PKC活性有不同程度的抑制作用。3.初步确定了o-HAs可以通过提高PTEN蛋白表达水平,并抑制Akt蛋白和MDR1基因的表达来调节PI3K/Akt细胞存活途径促进肿瘤细胞凋亡,进而实现逆转MDR的作用。4.可初步确定o-HA6和o-HA8的效果要强于o-HA4。本研究表明单一聚合度o-HAs毒性低具有较好的逆转MDR活性,其通过通过降低细胞内ATP水平,升高P-gp ATPase活性,抑制PKC活性,进而降低肿瘤细胞P-gp活性,同时调节P13K/Akt细胞存活途径促进细胞凋亡,从而逆转MDR,o-HAs可能成为逆转剂MDR候选化合物之一,具有深入研究的价值。