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目的：研究蔓荆子总黄酮(Fructus Viticis Total Flavonoids,FVTF)对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞(lung cancer stem cells, LCSCs)自我更新、增殖和侵袭等特性的影响,并探讨其潜在作用机制,为研发能根治小细胞肺癌药物提供实验依据。方法:体外培养人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞。采用CD133免疫磁珠分选法和干细胞条件培养基悬浮培养法分选和扩增CD133+球形成细胞。藻红蛋白(PE)荧光标记CD133抗体流式细胞术分析CD133阳性细胞百分率。光学显微镜观察细胞形态。四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性。肿瘤球形成试验、Transwell小室细胞侵袭试验、裸鼠皮下成瘤实验和western blot分析肿瘤干细胞标志物(CD44和ALDHl)、自我更新相关转录因子(Bmil、Nanog和OCT4)和侵袭相关转录因子(Twist1和Snail)蛋白表达水平。鉴别NCI-H446细胞系CD133+球形成细胞是否具有LCSCs特性以及不同浓度FVTF(0.5、1.0、2.0μg/mL)作用对LCSCs特性的影响。通过比较LCSCs和亲本细胞干细胞标志物(CD133、CD44、ALDH1)、磷酸化Akt、自我更新相关转录因子(Bmi1、Nanog和OCT4)和侵袭相关转录因子(Twist1和Snail)蛋白表达状态,检测不同浓度FVTF(0.5、1.0、2.0μg/mL)处理对LCSCs上述蛋白表达的影响,并考察PI3K特异性抑制剂LY294002(5.0、10.0、20.0μM)或两者联合处理调控LCSCs上述蛋白表达和抑制LCSCs特性作用,探讨FVTF通过降低细胞Akt蛋白磷酸化水平,进而下调CD133、CD44、ALDH1、Bmil、Nanog、OCT4Twist1和Snail蛋白表达,发挥抑制LCSCs功能和特性作用的可能机制。结果：1.CD133免疫磁珠分选得到的源自人肺癌NCI-H446细胞系CD133+细胞纯度高(CD133+细胞群：91.85±2.17%vs CD133-细胞群：0.03±0.01%,P<0.001)。CD133+细胞和亲本细胞均能在超低粘附6孔细胞培养板上的干细胞条件培养基中呈非粘附性三维球体生长,称之为肺癌球；CD133-细胞则不能形成肺癌球。CD133+细胞的肺癌球形成数(239±26/1000细胞)高于亲本细胞(64±11/1000细胞)的肺癌球形成数(P<0.05)。与亲本细胞相比,CD133+球形成细胞干细胞标志物CD44和ALDH1、自我更新相关转录因子(Bmil、Nanog和OCT4)和侵袭相关转录因子(Twistl和Snail)高表达；具有二次传代成球生长和单个细胞形成新肺癌球体能力；具有更高侵袭能力(CD133+球形成细胞：384±43/5000细胞vs亲本细胞：237±28/5000细胞,P<0.05)。1×103个CD133+球形成细胞就足够在Balb/c-nu小鼠皮下形成肿瘤(4/6),然而,在相应的同一模型下至少1×105个亲本细胞才能稳定导致肿瘤形成(3／6),此外,成瘤的时间长短亦有很大的差别(CD133+球形成细胞：18天vs亲本细胞：31天)。2.MTT比色法测定结果表明,FVTF相对选择性抑制LCSCs增殖活性(IC50值,CD133+球形成细胞：0.7μg/mL vs亲本细胞：33.7μg/mLP<0.05)。FVTF以浓度依赖方式下调LCSCs干细胞标志物CD133、CD44和ALDH1,自我更新转录因子Bmil、Nanog和Oct4,侵袭相关转录因子Twistl和Snaill蛋白表达。FVTF显著降低LCSCs的肺癌球形成数(P<0.05)和缩小肺癌球的体积,减弱LCSCs二次传代成球能力(P<0.05),呈浓度依赖性(P<0.05).FVTF(0.5、1.0、2.0μg/mL)以浓度依赖方式抑制LCSCs体外细胞侵袭能力(P<0.05).3. Western blot分析结果证明：LY294002以浓度依赖方式降低LCSCs细胞Akt磷酸化水平(P<0.05);同时,LY294002与FVTF协同下调LCSCs干细胞标志物CD133、CD44和ALDH1,自我更新转录因子Bmil、Nanog和Oct4,侵袭相关转录因子Twist1和Snaill蛋白表达。4.LY294002以浓度依赖方式抑制LCSCs肿瘤球形成能力(P<0.05)；此外,LY294002具有增强FVTF抑制LCSCs细胞增殖、肿瘤球形成和体外细胞侵袭作用。结论：1.综合应用CD133免疫磁珠分选法和干细胞条件培养基悬浮培养法获得的人肺癌NCI-H446细胞系CD133+球形成细胞具有LCSCs特性。2.FVTF具有抑制NCI-H446细胞系LCSCs功能和特性作用。3.FVTF抑制LCSCs特性作用机制涉及其降低LCSCs细胞AKT磷酸化水平,进而抑制干细胞标志物(CD133、CD44和ALDH1)和自我更新转录因子(Bmil、Nanog和Oct4)及侵袭相关因子(Twist1和Snaill)蛋白表达。