优化蝎毒肽Pacavin-5K的抗菌—抗癌功能机理研究

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目的对蝎毒多肽进行优化设计,获得具有活性好、稳定性好、毒性低的抗菌抗癌双功能蝎毒优化肽,并对其抗菌抗癌机制进行研究。方法首先,通过最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)实验,筛选出具有抗菌活性的蝎毒原始肽;通过氨基酸替代的方法对蝎毒原始肽进行优化设计;并通过体外毒性实验、稳定性实验,从中筛选出抗菌活性好、毒性低、稳定性好的优化多肽。再次,通过杀菌动力学、荧光动力学、DNA阻滞实验来探究优化多肽的体外作用机制。并探究该优化多肽对细菌生物被膜的影响,以及是否会诱导耐药性。同时还通过建立小鼠皮肤感染模型,来研究该优化多肽的体内抗菌活性。最后,通过MTS实验来检测该优化多肽对癌细胞增殖能力的影响。进一步通过细胞膜实验、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡的检测、活性氧的检测、细胞线粒体膜电位的检测来探究该优化多肽对癌细胞的作用机制。结果筛选获得一个活性较弱的抗微生物多肽Pacavin,通过优化设计获得了一个抗菌活性好、毒性低、稳定性好的优化蝎毒肽Pacavin-5K。Pacavin-5K对Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa的MIC为6.25-12.5μg/m L。在经过60摄氏度24小时加热后,Pacavin-5K对Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa的MIC没有发生变化。Pacavin-5K在和血清孵育半小时后,对Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa的MIC都没有发生变化,孵育2小时后,对Staphylococcus aureus的MIC没有发生变化,对Pseudomonas aeruginosa的MIC由原来的12.5μg/m L变成了25μg/m L。杀菌动力学实验显示,Pacavin-5K可以快速杀灭Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa且具有浓度和时间依赖性;荧光动力学实验显示,Pacavin-5K以浓度和时间依赖性方式破坏Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa的细胞膜;DNA阻滞实验显示,Pacavin-5K可与DNA结合,且与DNA的结构无关;抗生物被膜实验中,Pacavin-5K可抑制Staphylococcus aureus生物被膜的形成,而对Pseudomonas aeruginosa生物被膜的形成却没有影响;同时,Pacavin-5K不易诱导Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa产生耐药性;在小鼠皮肤感染模型中,Pacavin-5K和抗生素组均能显著降低感染部位的菌载量,并且二者无显著差异。在抗癌功能研究中,Pacavin-5K可有效抑制肺癌细胞A549的增殖。细胞膜完整性实验显示,Pacavin-5K可破坏肺癌细胞A549细胞膜完整性;ANNEXIN V-FITC/PI凋亡实验显示,Pacavin-5K可导致肺癌细胞A549早期和晚期凋亡;细胞活性氧检测显示,Pacavin-5K可引起肺癌细胞A549活性氧的积累;细胞线粒体膜电位检测显示,Pacavin-5K可引起肺癌细胞A549线粒体膜电位下降。结论通过本研究,获得了活性好、毒性低、稳定性好的优化多肽Pacavin-5K。Pacavin-5K可通过破坏细胞膜,与DNA结合达到抗Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa的作用。Pacavin-5K可以抑制Staphylococcus aureus生物被膜的形成,且不易诱导Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa产生耐药性。同时,Pacavin-5K在体内也具有良好的抗Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa活性。除此之外,Pacavin-5K对肺癌细胞A549的增殖有抑制作用,并且可诱导肺癌细胞发生凋亡。综上,Pacavin-5K可用于治疗Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa引起的皮肤感染,还具有治疗肺癌及其伴随细菌感染的潜力。
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