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目的: 此研究旨在揭示普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ类和β2m基因的特征,阐明狨猴MHC-Ⅰ类蛋白的结构特征,丰富狨猴的MHC-Ⅰ类分子背景资料,提高后续挑选狨猴作为实验动物时的稳定性和重复性,为后续了解狨猴对HCV特异性细胞免疫保护反应的分子机制和疫苗免疫研究提供重要信息。 方法: 1、研究对象 普通棉耳狨猴common marmosets(Callithrix jacchus)3只,雄性,体重300-400g左右/只。 2、实验方法 (1)普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ重链蛋白分子制备:采用RT-PCR技术从狨猴PBMC中扩增MHC-Ⅰ类等位基因全长,根据单倍型克隆数≥2的原则,确定能编码完整蛋白的MHC-Ⅰ类等位基因。利用DNAMAN5.2.2软件对等位基因的序列进行综合比对,并将等位基因的碱基序列翻译为氨基酸序列后比对,利用MEGA4.1软件制作系统进化树进行狨猴等位基因分析。挑选出现频率最高的等位基因,并在其羧基端加上BSP基因后插入原核表达载体中进行表达,SDS-PAGE、WB鉴定表达情况。镍柱纯化。 (2)普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ轻链β2-microglobulin蛋白分子制备:采用RT-PCR技术从狨猴PBMC中扩增β2m的mRNA基因。用DNAMAN和DNAstar软件对序列进行分析,并与其他灵长类动物及不同物种的β2m进行同源性比对、系统进化分析。亚克隆β2m成熟肽基因,插入原核表达载体pET-28a(+)中,并通过SDS-PAGE和WB鉴定其表达。镍柱纯化。 (3)普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP和β2m成熟肽结构分析及可溶性单体制备和鉴定:运用BioEdit和DNAstar对MHC-Ⅰ-BSP蛋白以及β2m成熟肽蛋白一级结构进行分析,Protscale程序进行蛋白疏水性分析,ANTHEPROT程序进行蛋白质理化特性分析,NetPHos2.0 Server进行蛋白质磷酸化位点分析。用圆二色谱、SOPMA和PredictProtein软件对蛋白二级结构进行预测。利用SWISS-MODEL程序对蛋白进行同源建模分析。采用Altman首创的四聚体制备方法尝试了狨猴MHC-Ⅰ/肽可溶性单体的制备。 结果: (1)MHC-Ⅰ重链蛋白分子制备 从3只普通棉耳狨猴PBMC中克隆的MHC-Ⅰ类等位基因扩增产物全长为1100bp左右,共得到了116个MHC-Ⅰ等位基因克隆,根据单倍型克隆数≥2的原则,从中确定了7个能编码为完整蛋白的Caja-G等位基因和1个假基因。新确定的MHC-Ⅰ类等位基因均被划分为Caja-G型等位基因。将序列翻译为氨基酸序列后与人的HLA-G进行比对,可见Caja-G等位基因序列呈现高度的多态性。狨猴MHC-Ⅰ类等位基因序列包含胞外段(α1-α3),跨膜段和胞内段,胞外段。远膜端α1、α2结构域其氨基酸排列顺序变化较大,共同构成了抗原结合槽,是Ⅰ类分子多态性的基础。近膜端的α3结构域氨基酸序列较为保守。挑取了加上之前本课题组研究的总共12只狨猴中出现频率最高的等位基因Caja-G*09∶03作为需要表达的蛋白。Caja-G*09∶03携带率相对较高,预期Caja-G*09∶03构建的四聚体具有较好的可行性和应用前景。并通过PCR技术将BirA酶底物肽(BSP)基因连接到了Caja-G*09∶03胞外域的羧基端,Caja-G*09∶03胞外域-BSP插入原核表达载体pET-28a(+)中,鉴定其表达后进行了条件优化使其大量表达。Caja-G*09∶03-BSP(MHC-Ⅰ-BSP)蛋白分子大小约34kDa。包涵体洗涤溶解后,SDS-PAGE结果显示包涵体纯度较纯。由于缺乏针对狨猴Caja-G的单克隆抗体,此处采用针对His标签的抗体检测蛋白表达。Western Blot显示蛋白大小与SDS-PAGE一致。并用镍柱对蛋白进行了纯化。 (2)MHC-Ⅰ轻链β2-microglobulin蛋白分子制备 克隆的β2m的mRNA基因全长为357bp,前20个氨基酸为信号肽部分,后99个氨基酸为成熟肽部分,与GenBank中普通棉耳狨猴β2m的mRNA序列(XM_002753411.2)同源性为100%,证明了其高度保守性。亚克隆了β2m基因的成熟肽部分,将β2m基因的成熟肽基因插入原核表达载体pET-28a(+)中进行蛋白表达。SDS-PAGE结果显示蛋白大小约为12kDa,与理论预测值一致。采用针对狨猴β2m的单克隆抗体和His标签抗体对蛋白进行了鉴定,分子大小一致,说明β2m正确表达。用镍柱对蛋白进行了纯化。 (3)蛋白结构分析及可溶性单体制备和鉴定 普通棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP蛋白(Caja-G*09∶03-BSP)和β2m成熟肽蛋白预测分子量分别为33.63KDa和11.60KDa。与之前原核表达的结果一致。其理论假设的等电点pI分别为5.085和7.355。MHC-Ⅰ-BSP蛋白疏水性为1.389,β2m成熟肽蛋白疏水性为1.122。棉耳狨猴MHC-Ⅰ-BSP蛋白存在着21个潜在的磷酸化位点,β2m蛋白8个潜在的磷酸化位点。SOPMA预测的MHC-I-BSP蛋白以α-螺旋、β-折叠和随机卷曲为主。PredictProtein预测的MHC-I-BSP蛋白α-螺旋占据22.3%,β-折叠为32.6%,其他结构为45%。β2m成熟肽蛋白SOPMA预测的蛋白二级结构主要以β-折叠和随机卷曲为主,其中最主要的结构元件为β-折叠,占43.43%,α-螺旋最少,仅4.04%。PredictProtein预测的结果与SOPMA结果基本一致,其不含α-螺旋,β-折叠比例为45.5%。圆二色谱仪(JASCO J-810)测定CD值与软件预测存在较大的差异。蛋白同源建模分析显示狨猴MHC-I-BSP蛋白的3D结构与人的HLAⅠ的3D结构相似,由2个反向平行的α螺旋和8个β片层组成,具有一个抗原结合槽。α3由7条β片层组成。β2m蛋白的3D结果与人的β2m蛋白的3D结构类似,由7个β片层组成,无α螺旋。采用Altman首创的四聚体制备方法尝试了狨猴MHC-Ⅰ/肽可溶性单体的制备,为进一步制备MHC-Ⅰ/肽四聚体做准备。选取前期实验狨猴T细胞反应检测中具有强反应性的HCV E1(E1-282)和已报道的人HLA-A2优势表位肽NS3(CV9)构建Caja-G*09∶03限制性的MHC-Ⅰ/肽可溶性单体,但折叠后复合物经HPLC和ELISA鉴定后未发现有单体形成,在优化反应条件及改变浓缩方式、纯化方法后均未发现单体形成。对此结果进行了分析。 结论: (1)利用RT-PCR技术从3只普通棉耳狨猴PBMC中扩增了MHC-Ⅰ类等位基因重链和β2m基因,并对加上之前本课题组研究的总共12只狨猴的MHC-Ⅰ类等位基因序列进行了详细的分析,丰富了狨猴MHC-Ⅰ类等位基因遗传背景。 (2)亚克隆了Caja-G*09∶03胞外域和β2m成熟肽基因,在Caja-G*09∶03胞外域羧基端连接上了BSP基因,使其羧基端可以成功标记上生物素,为下一步构建狨猴的MHC四聚体研究奠定了基础。 (3)将狨猴Caja-G*09∶03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽基因连接至pET-28a(+)原核表达系统,进行了原核表达并对其表达条件进行了优化,蛋白以包涵体的形式进行了高效表达。并用镍柱进行了纯化。 (4)运用测序所得基因序列推导的氨基酸序列和生物信息学软件、圆二色谱(CD)对狨猴Caja-G*09∶03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽的一级结构和二级结构进行分析,并运用同源建模构建了狨猴Caja-G*09∶03胞外域-BSP基因和β2m成熟肽蛋白的三级结构(3D)模型。蛋白质结构分析为狨猴HCV/GBV-B嵌合病毒模型CD8+T细胞免疫反应的研究提供了遗传背景和重要信息。 (5)采用Altman首创的且是目前最常用于MHC-Ⅰ/肽四聚体制备的技术对普通棉耳狨猴Caja-G*09∶03限制性的MHC-Ⅰ/肽四聚体制备进行了尝试。虽经HPLC和ELISA鉴定无单体形成,但本实验对未形成单体原因进行了分析,并为后续的实验提供了清晰的方向。