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代谢控制分析理论(MCT)一经提出就引领代谢工程取得里程碑式发展并被广泛应用到基础理论研究和生产实际等领域,但是至今仍受两大难题困扰,即获得酶活性的扰动和通量控制系数(FCCs)的计算,以往的方法往往需要借助基因操作和复杂的计算推理,难以实现,致使MCA的发展和应用受到约束。
大量研究表明,数量性状基因座(QTL)效应和通量控制系数(FCCs)具有极其相似的分布规律,均呈L-形分布,即代谢通量具有与数量性状一致的遗传变异规律。从分子水平上看,控制数量性状的基因必然跟编码该性状代谢途径中各种酶及其调节因子的基因有着密切的联系,而且控制数量性状的众多基因极有可能正是通过调节其代谢途径中酶的活性来控制的。因此,本文将螺旋藻(spirulina)β-胡萝卜素(β-carotene)的代谢通量作为一个数量性状,估算了β-胡萝卜素代谢通量的重复力、广义遗传力、狭义遗传力及遗传进度。并首次运用主成分分析、通径分析等数量遗传学成熟而广泛应用的分析方法来研究其代谢途径中酶对通量的影响方式和程度。
在相关分析的基础上分别建立并计算了基于主成分分析的控制系数Cpi和基于通径分析的控制系数R2i,对比分析表明这两组控制系数的变化规律基本一致,均表明螺旋藻β-胡萝卜素合成途径中番茄红素-β-环化酶(LYC-B,CpINC-B=0.161,R2LVC-B=0.2601),RuBP羧化酶(RuBisCO,CpRuBisCO=0,121,R2RuBisCO=0.2453),磷酸甘油酸变位酶(PGM,CpPGM=0.163,R2PGM=0.2320),丙酮酸脱氢酶(PDHC,CpPDHC=0.119,R2PDHC=0.1584)和异柠檬酸脱氢酶(ICDH,CPICDH=0.172,R2ICDH=0.1935)等5种酶对β-胡萝卜素的代谢通量起主要控制作用。
为了验证Cpi和R2i的科学性和可行性,本文采用代谢控制理论的分析方法,用温度作为代谢扰动手段,通过lin-log动力学方法对试验数据进行分析,估算弹性系数(elascity coefficients),进而确定了各种酶的通量控制系数。结果表明番茄红素-β-环化酶(LYC-B,CJLYC-B=0.2316),RuBP羧化酶(RuBisCO,CJRuBisCO=0.1993),磷酸甘油酸变位酶(PGM,CJPGM=0.1836)和异柠檬酸脱氢酶(ICDH,CJICDH=0.2063)对β-胡萝卜素代谢通量有较高的控制作用。
对比和相关分析均表明Cpi和R2i与FCCs具有极好的一致性,这说明本项研究将数量遗传学分析方法应用到螺旋藻β-胡萝卜素代谢控制分析中是完全可行的。这一方面大大简化了代谢控制分析,为代谢工程育种及代谢控制分析提供了一条新的思路:另一方面从某种程度上证实了数量性状的确是通过调节代谢途径中的酶活来控制的,所谓“微效多基因作用”实际上应该是“决定数量性状的代谢途径中多种酶对代谢通量的贡献”。同时这两种方法的成功建立也将代谢工程和数量遗传学这个两个学科紧密地结合在一起了,可以将数量遗传学的更多研究方法应用到代谢工程中解决一些难题,也可以将代谢网络调控的思想引入到数量遗传学的基础理论研究中去,这将给动植物育种学家、数量遗传学基础和应用研究以及代谢工程科研工作者提供理论基础。