论文部分内容阅读
海参具有较高的营养和药用价值,一直是单品经济价值较高的海产品。然而受外界不利环境因素刺激后,海参极易自溶。课题组研究发现,内源蛋白酶是自溶的主导因素。,其中丝氨酸蛋白酶(serine protease,SEP)是参与海参自溶的主要蛋白酶类型之一。生物体内SEP的活性受其内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,SPI)的严格调控。目前海参自溶过程中SPI和SEP基因水平的变化及其相互关系的研究未见报道。因此,本文克隆了海参SPI基因,并研究自溶过程中SPI和SEP基因的表达情况,从两者相互关系的角度研究海参自溶机制。提取刺参肠RNA,反转录后应用PCR及RACE技术克隆得到SPI基因序列。其全长846 bp,阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。理论等电点7.36,分子量14.48 kDa。含有两个Kazal-type家族的Kazal结构域。采用实时荧光定量PCR方法考察SPI、SEP基因在刺参不同组织中分布以及自溶过程中的表达情况。结果表明SPI和SEP基因在刺参的纵肌、呼吸树、肠、腹部管足、背部表皮和体腔细胞中均有表达,均在肠中表达量最高。刺参自溶过程中,在背部表皮SPI和SEP的表达水平在0 h到3 h出现不同程度下降,在5 h均出现一个峰值,之后又呈下降趋势。在腹部管足,出水后SPI的表达量迅速下降,5h之后显著升高,在9 h出现峰值,11h剧烈下降后再次上升。SEP的表达量在7h内保持较低水平,在9 h出现峰值,但表达量均低于0 h。背部中SEP/SPI的比值均大于0 h,说明SEP表达量的增加幅度大于SPI。腹部管足中在3 h SEP表达量的增加幅度大于SPI,其他自溶阶段的SEP表达量的增加幅度小于SPI。此外,构建重组质粒pET-21b-SPI并转化到大肠杆菌Arctic Express中,经IPTG(终浓度0.5 mM)诱导得到重组蛋白SPI。以上结果表明,SPI和SEP基因在刺参多种组织均有分布,并具有一定组织特异性。在刺参自溶过程中,SPI和SEP的消长规律不同,这可能反映刺参对外界刺激的不同应答反应。自溶过程中SEP/SPI比值的变化说明SEP和SPI之间的平衡被打破,导致刺参蛋白降解,这可能是刺参发生自溶的主要原因之一。重组蛋白SPI的获得为研究刺参自溶过程中蛋白水平SPI对SEP的调控作用奠定基础。