SARS-CoV是正义单链病毒，基因组全长约为29.7kb。它是一种与之前所报道的各种冠状病毒不同的新的病毒，是引起2002-2003年全球爆发的人类严重急性呼吸综合症(SARS)的元凶。 本文主要研究SARS-CoV中的其中一个结构蛋白——刺突蛋白(S)。在SARS-CoV引起的细胞膜融合过程中，S蛋白起着至关重要的作用。S蛋白与受体的结合亲和力如何，直接决定病毒对靶细胞的感染活性，同时S蛋白也是SARS-CoV的一个重要的抗原位点，针对这一抗原位点的深入研究可以为疫苗研究寻求有效的靶点奠定坚实的基础。本研究根据对SARS不同来源株的S蛋白的核苷酸多序列的比对，计算其相应位点的突变墒值和突变几率后，结合进一步的生物信息学分析(核苷酸和蛋白质一级结构比较、结构域等二级结构分析及蛋白质折叠、功能预测等)，先从数十个突变热点中筛选出经预测可能影响S蛋白与其受体结合进而导致SARS病毒对宿主细胞的膜融合侵染能力的7个位点，参照文献设计特异性引物和突变引物，利用重叠延伸PCR法(OE-PCR)或直接PCR法进行人工定点突变。 研究中先将S蛋白的读码框(ORF)序列利用限制性内切酶XhoⅠ、PstⅠ、HindⅢ、SalⅠ、Bgl Ⅱ和ClaⅠ切割成五个DNA片段并亚克隆至经相同酶切的pSP72中问载体中，针对经序列分析确定的7个突变位点，设计突变引物分别进行单个位点的定点突变体的构建，获得相应的突变体，继而构建野生型和突变体的逆转录病毒载体(PLNCX2)系统PLNCX2/Spike。 通过以上实验，已成功获得了SARS-CoV Spike野生型和七个位点突变型的PLNCX2载体的重组子，可为研究这些突变位点在Spike蛋白与受体结合中的意义，进而可为阐述Spike蛋白的结构与功能的关系、揭示Spike蛋白变异与SARS病毒侵入(染)细胞能力的相关性提供坚实的实验依据。研究细胞膜融合蛋白与受体的结合的方法多用细胞-细胞融合实验，为了能有效地观察细胞-细胞融合的效果，建立了T7 RNA聚合酶/T7启动子载体系统。设计引物从大肠杆菌BL21中扩增T7 RNA聚合酶基因序列，并将后者插入真核表达载体pRc/CMV2中，构建质粒pRc/CMV2-T7P，作为T7 RNA聚合酶的供体，而T7 RNA聚合酶特异识别的T7启动子序列则通过人工合成，并插入带有报告基团——荧光素酶的表达载体pGL3中，构建质粒pGL3-T7。因为pGL3质粒虽然含有荧光素酶序列，但因为缺乏有效的RNA聚合酶，所以不能单独表达；而RNA聚合酶的作用又必需由pGL3-T7中的T7启动子启动。利用将T7 RNA聚合酶的表达序列和T7 RNA聚合酶启动子分别构建于不同的载体中，将两质粒分别转染效应细胞和靶细胞，可以此来观察两者之间的融合情况。如果它们有融合，则可表达荧光素酶蛋白，可用荧光素酶底物检测到，反之则无表达。 本研究已成功构建以上载体，并共转染A549细胞和VERO E6细胞，可在细胞裂解液中检测到荧光素酶蛋白的表达，说明此系统是可用的。构建的系统可广泛应用于细胞与细胞的融合研究中，是一个非常实用的工具系统。为本课题接下来的不同突变体的融合效果的研究打下坚实基础。