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NKX3.1是前列腺细胞特异表达的受雄激素调控的同源盒基因。人NKX3.1基因位于染色体8p21,基因全长约4.2 kb,编码234个氨基酸,其产物在结构与功能上属于核转录因子,具有抑制前列腺上皮生长及维持分化的作用。研究发现约80%的人前列腺癌中存在8p21区域的杂合缺失,表明NKX3.1在前列腺癌中可能作为抑癌基因发挥作用,它的表达缺失不仅与前列腺癌的起始及进展有密切关系,而且决定了肿瘤发生的组织特异性。前列腺癌基因1(PCAN1)是新近发现的前列腺特异表达的基因。在前列腺癌细胞株中,只有LNCaP细胞微弱表达PCAN1基因,其它几种低分化高转移的细胞株(PC-3,DU145)检测不到PCAN1基因的表达。PCAN1定位于染色体4q21,此区域在前列腺肿瘤中常杂合缺失,约35%的前列腺肿瘤标本中有PCAN1基因突变,提示PCAN1基因有可能在前列腺肿瘤中作为肿瘤抑制基因发挥作用。NKX3.1和PCAN1都是与前列腺上皮分化及前列腺癌密切相关的前列腺特异表达的基因,它们在细胞分化及肿瘤发生中的确切机制及其基因表达调控机制尚不完全清楚,有待于深入研究。最近我们在对NKX3.1基因的研究中,发现转染NKX3.1 cDNA表达质粒可上调前列腺癌LNCaP细胞中PCAN1基因的表达。本课题旨在启动子-报道基因水平及基因转录水平研究NKX3.1对前列腺癌细胞中PCAN1基因表达的调控作用,并初步探讨其调控机制。在本实验中,(1)首先构建了NKX3.1 cDNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞LNCaP和PC-3,利用RT-PCR和Western blotting检测该表达载体的表达效率。(2)构建了NKX3.1siRNA真核表达载体,转染LNCaP细胞,利用RT-PCR和Western blotting鉴定NKX3.1被干扰沉默的效率,并筛选鉴定稳定转染的LNCaP细胞株。(3)利用PCR扩增PCAN/基因5’上游2.6 kb启动子片段(+32bp～-2598 bp),构建PCAN12.6 kb启动子-荧光素酶报道基因质粒并检测PCAN1启动子活性。(4)将PCAN1启动子-荧光素酶报道基因质粒与NKX3.1真核表达载体共转染LNCaP细胞,双荧光素酶报告基因系统和RT-PCR分别检测NKX3.1对PCAN1启动子活性和mRNA表达的影响。(5)用RT-PCR检测在NKX3.1被干扰沉默后的LNCaP细胞中PCAN1 mRNA表达的变化。(6)使用MatInspector 2.2软件分析克隆的PCAN1 2.6 kb片段,显示该片段上可能存在的顺式作用元件,其中有5个潜在的NKX3.1结合位点(NKX3.1 Binding Site NBS),通过染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation ChIP),双荧光素酶报告基因系统,电泳迁移率变动实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA)检测5个NKX3.1结合位点(NBSs)与NKX3.1转录因子的结合活性。(7)在鉴定出2个NBS元件与NKX3.1有结合活性后,进一步构建了这2个元件的内缺失质粒,与NKX3.1 cDNA真核表达载体共传染LNCaP细胞,双荧光素酶报告基因系统分析进一步证实NKX3.1对PCANl基因启动子活性的调控作用。结果显示:(1)成功构建了NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1,瞬时转染PC-3和LNCaP细胞后能有效表达。(2)构建的NKX3.1 siRNA真核表达载体pRNAT-NKX3.1 RNAi1在稳定转染的LNCaP细胞株中可有效沉默NKX3.1的表达。(3)克隆了人PCAN1基因上游2.6 kb片段,构建的2.6 kb片段启动子-荧光素酶报告基因质粒在前列腺癌细胞LNCaP中显示有较强的启动子活性。(4)在LNCaP细胞中,共转染pcDNA3.1-NKX3.1可增强PCAN1启动子活性和PCAN1mRNA的表达,而NKX3.1表达被干扰RNA沉默后,可使PCAN1 mRNA表达降低。(5)鉴定了PCAN1基因上游的2个NKX3.1结合元件(NBS1:-1848bp～-1836bp,NBS3:-803bp～-791bp),并进一步证实了这2个元件参与NKX3.1对PCAN1基因表达的正向调控作用。结论:本研究结果表明,NKX3.1可与PCAN1基因上游的2个功能性的NKX3.1结合元件结合,正向调控PCAN1基因的表达。这一研究结果为深入研究NKX3.1和PCAN1在前列腺上皮分化及前列腺癌中的作用奠定了基础。