穿孔素(perforin，PFP)，一种酸性糖蛋白，主要储存于细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞胞浆颗粒中，是发挥细胞毒性作用的重要的细胞因子。血液及组织液中穿孔素的水平，可以反映出机体的细胞免疫功能状态。目前实验室检测穿孔素方法主要有酶联免疫吸附、免疫组化等免疫学方法。由于抗体制备周期较长、不易保存、对检测环境要求较高等缺点，造成该项目检测费用较高，患者难以承受。因此建立一种快速便捷的检测方法对细胞免疫功能缺陷疾病的预防和治疗具有重要意义。　　适配体作为一种新型分子识别元件，不仅对靶物质表现出特异性的识别力和高度的亲和力，还具有许多抗体不能比拟的优越性能，如分子量小、易于合成和标记、靶标范围广、容易保存等。基于适配体的电化学传感器具有灵敏度高，特异性强，操作简单，成本低廉等优点，成为快速及痕量检验的理想设计策略。该研究利用磁珠分离 SELEX技术筛选穿孔素适配体，并构建了两种电化学适配体传感器。基于氯化高铁血红素/G4链体电化学适配体传感器中的设计探针是针对适配体SEQ6设定，分子识别元件不能选用其它适配体，而基于SWCNHs@HPtCs的传感器相对无适配体选择性，还可用于验证其他适配体和穿孔素的结合性能。　　目的:　　筛选出具有高亲和力、高特异性的穿孔素适配体，利用筛选到的适配体构建建灵敏度较高，特异性强的电化学生物传感器，对适配体和穿孔素的结合性能进行验证，并将传感器应用于穿孔素的检测。　　方法:　　1.利用指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）筛选穿孔素适配体，采用磁珠分离法，ssDNA文库与酵母tRNA竞争结合包被了穿孔素的羧基化磁珠，根据次级 ssDNA 定量的结果对下轮筛选条件进行设定，通过结合、分离、PCR扩增、分离ssDNA、再结合等循环，ssDNA文库被有效富集，对筛选产物进行克隆测序，M-fold程序预测二级结构，ELISA测定亲和力。　　2.随机选取6条ssDNA中的1条（SEQ6），构建基于氯化高铁血红素/G4链体模拟过氧化物酶的电化学适配体传感器，采用循环伏安法监测传感器的组装，对核酸外切酶与底物的孵育时间和氯化高铁血红素的加入浓度进行优化；优化条件下对不同浓度的穿孔素进行检测并制定校正曲线，循环伏安法对传感器进行特异性和稳定性检测。　　3.通过还原法合成中空纳米铂链，进一步合成单壁碳纳米角/空心纳米铂链复合物复合物，分别进行SEM表征；利用SWCNHs@HPtCs复合物为载体固载氨基二茂铁和穿孔素抗体,构建基于SEQ4和SWCNHs@HPtCs的类夹心免疫新型电化学传感器。采用循环伏安法监测传感器的组装，采用差分脉冲伏安法（DPV）对底液的pH值和复合物与穿孔素的孵育时间进行优化；优化条件下检测不同浓度穿孔素并制定校正曲线，循环伏安法检测稳定性，DPV检测重复性及特异性。　　结果:　　1.磁珠表面蛋白包被效率为 83%，达到预期包被效果，经过 12 轮筛选循环，对产物克隆测序后得到6条ssDNA序列，二级结构预测可知，6条适配体结构各异，但均有明显的茎环结构，符合适配体结构特征，SEQ1和SEQ5具有相对较低的吉布斯自由能，它们形成的二级结构相对比较稳定亲和力分析中，6条ssDNA与穿孔素结合的OD值均大于1.5，均有较高的亲和力。　　2.基于氯化高铁血红素/G4链体模拟过氧化物酶的电化学适配体传感器，酶与底物最佳孵育时间为90min，hemin的最优加入浓度为2μM，穿孔素的浓度在1～20nM范围时与电流变化呈线性，线性方程为i=-0.311c-1.054，r2=0.973，检出限为0.7nM；传感器对干扰物质的电流反应远小于穿孔素；对传感器进行 50 个循环的连续扫描，解析电流值下降了6.8%；4℃避光保存15天，解析电流值下降了9.88%。　　3.基于SWCNHs@HPtCs复合物的电化学适配体传感器，经过优化，底液的最佳pH为6.5，复合物与穿孔素的最佳孵育时间为60min。穿孔素的浓度在1～20nM范围时与电流变化呈线性，线性方程为I=0.616c+4.601, r 2=0.963检出限为0.56nM；传感器对干扰物质的电流反应远小于穿孔素；对传感器进行 50 个循环的连续扫描，解析电流值下降了6.3%；4℃避光保存20天，解析电流值下降了9.7%，具有较高的稳定性；重复性测定相对标准偏差值为4.4%。　　结论:　　1.通过磁珠分离SELEX技术，以穿孔素为靶标筛选出6条具有高亲和力的适配体，为穿孔素的临床检测提供了新的方向；　　2.成功构建了基于两种电化学适配体传感器，两种传感器选用的适配体、检测方法及信号放大策略均不相同但检测穿孔素的线性范围相同，基于SWCNHs@HPtCs的传感器具有更低的检出限。两种传感器均具有电流响应快，灵敏度高，稳定性好，选择性好的特点，均可应用于穿孔素的检测。