骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是全球最常见的关节退行性疾病,其中又以膝关节骨关节炎发病率最高。在发达国家,随着民众年龄的增加和人口老龄化的到来,膝关节骨关节炎的发病率持续增高,相应的其医疗支出也逐年增加,并给各国医疗系统造成了承重的负担。在我国,膝关节骨关节炎(Knee Osteoarthritis,KOA)的发病呈现出逐年增加的趋势,给广大人民群众尤其是老年人的健康造成了重大威胁。膝关节骨关节炎的主要症状为关节疼痛和活动障碍,中晚期骨关节炎患者常常无法生活自理,虽然不致命但常常严重降低患者的生活质量。目前膝关节骨关节炎的诊断缺乏特异性指标,患者往往因关节疼痛伴活动受限来院就诊,就诊时往往已处于病程的中晚期。目前针对骨关节炎的治疗主要分为保守治疗和手术治疗。保守治疗包括理疗、药物治疗、支具治疗和改善生活习惯等。从目前患者的临床反馈来看,保守治疗仅仅对一部分患者有效,其它患者对保守治疗无效或者疗效较差,部分患者在使用药物过程中甚至出现药物副作用。手术治疗包括关节镜、关节置换、关节融合和关节周围截骨手术等,手术治疗主要适用于中晚期膝关节骨关节炎,但是其临床花费较高,往往给患者给社会造成沉重的经济负担。除此之外,部分患者手术后的效果仍然难以令人满意,少部分患者甚至会碰到如感染、假体周围骨折、假体松动等手术相关并发症,严重影响患者对手术治疗的满意度。因此,如何选择稳定的生物学标志物预测膝关节骨关节炎的发病风险,帮助早期诊断膝关节骨关节炎,并寻找新的有效治疗靶点,据此进行个体化治疗,以提高患者的生存质量,是目前国内外研究的热点。越来越多的研究表明,个体遗传因素在膝关节骨关节炎患者的发病中扮演了重要的角色。因此,寻找包括单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)在内的一些遗传分子标志物用于早期诊断,探索新的治疗靶点,是目前国内骨科学研究领域的热点。近年来,随着人类基因组计划的完成和功能学研究的进展,大量的潜在致病遗传SNP位点被发现,如何有效的筛选和验证这些SNP位点十分重要。Regulome DB数据库整合了包括来自ENCODE和其它来源的高通量实验数据,利用计算和人工标注预测具有潜在调节功能的基因变异。该数据库根据现有证据对功能变异位点进行1-6分的评分。分数越低,现有的证据越支持该位点具有调节功能,分数越高,则反之。使用Regulome DB筛选潜在的功能位点有助于发现真正有意义的遗传变异,目前已有部分研究通过该数据库发现了疾病的致病多态位点。因此,本研究作者应用Regulome DB数据库筛选目标基因的潜在致病功能多态位点并进一步验证,探讨其与骨关节炎的易感性。人类基因组仅有1.5%的基因具有蛋白编码功能,其余的基因均为非编码基因。70%-90%的人类基因组转录产物与蛋白编码无关,这些转录产物称为非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)。最初的研究认为这些非编码RNA不具有任何生物学功能。随着探索的不断深入,越来越多的研究发现非编码RNA在生物的生长、发育、代谢和凋亡等活动中起着非常重要的作用。根据RNA长度的不同,可以将非编码RNA分为短链非编码RNA和长链非编码RNA,短链非编码RNA是长度小于200个核苷酸的RNA分子如micro RNA,小干扰RNA(small-interfering RNA,si RNA)等。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是长度大于200个核苷酸的RNA分子。已有多项研究发现与正常人相比,膝关节骨关节炎患者的软骨中lnc RNA呈现差异化的表达状态,但各种研究结果之间尚缺乏一致性,且差异化表达的lnc RNA致膝关节骨关节炎的致病机制尚未明了。因此深入探究lnc RNA参与膝关节骨关节炎发病的具体机制,将有助于更好的理解骨关节炎的发病机理,寻找新的诊断标志物和治疗靶点。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是一组进化保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,它们接受一系列细胞外刺激信号刺激后激活,进而介导信号从细胞膜外向细胞核内传导过程。该途径调控着细胞的许多生理病理活动,如代谢、凋亡、癌变等。其中MAPK/ERK通路是该途径中最重要的通路之一。已有研究报导MAPK/ERK通路参与了膝关节骨关节炎患者软骨细胞的代谢调节,进而与膝关节骨关节炎发生发展相关。丝裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)是该通路的关键蛋白,存在MEK1和MEK2两种亚型。目前尚没有关于MAPK/ERK基因遗传变异对膝关节骨关节炎遗传易感性的研究报道。探索该通路关键蛋白编码基因遗传变异与膝关节骨关节炎遗传易感性的关系将有助于我们深入理解膝关节骨关节炎的发病机制,寻找新的诊断标志物和治疗靶点。因此,本研究拟在前期发现的差异化表达lnc RNA和MAPK/ERK通路参与膝关节骨关节炎发病的基础上,应用Regulome DB数据库预测所有候选基因的潜在功能SNP,进一步探讨其作为骨关节炎诊断标志物和治疗靶点的可能性。本研究结果可以发现与膝关节骨关节炎遗传易感性相关的生物标志物,可将其用于骨关节炎的早期诊断,并可能对今后的个体化治疗具有重要的现实意义。第一部分lnc RNA遗传变异与膝关节骨关节炎遗传易感性的关联研究膝关节骨关节炎是世界上最常见的慢性退行性疾病之一。多项研究发现lnc RNA在关节软骨的合成和分解代谢中起到重要作用,并在正常人和骨关节炎患者的软骨之间呈现差异化表达,进而参与骨关节炎的发生发展。作者检索了pubmed、medline数据库(2010年1月-2017年10月),筛选出有文献报道的在骨关节炎和正常软骨组织之间存在差异表达的的lnc RNA共15个,应用Regulome DB数据库预测对所有15个lnc RNA的潜在功能SNP位点进行预测,选取Regulome DB评分为1-2b,共10个SNP位点。收集2014年-2017年在常州市第一人民医院收集的278例膝关节骨关节炎患者和年龄、性别匹配的289例健康对照。潜在功能位点进行基因分型。随后使用单因素和多因素logistic回归模型分析遗传变异与骨性关节炎之间的关联及其强度。研究结果发现lnc RNA H19 rs2067051和膝关节骨关节炎的发病相关联。在调整过年龄、性别和身体质量指数(Body Mass Index,BMI)后,等位基因T能够显著降低膝关节骨关节炎的发病风险:纯合子模型(TTvs.CC)、隐性模型(TTvs.TC+CC)、相加模型结果分别为(OR=0.61,95%CI:0.39-0.95,P=0.03)、(OR=0.64,95%CI:0.41-0.97,P=0.03)、(OR=0.81,95%CI:0.66-0.99,P=0.03),调整过年龄、性别和BMI后隐性模型和相加模型的结果分别为(OR=0.61,95%CI:0.39-0.95,P=0.03)、(OR=0.79,95%CI:0.64-0.98,P=0.03)。MEG3 rs4378559和膝关节骨关节炎的发病也存在相关性,相加模型结果为(OR=1.32,95%CI:1.01-1.74,P=0.04)。上述结果表明lnc RNA H19和MEG3的遗传变异和膝关节骨关节炎的发病风险显著相关。第二部分MAPK/ERK通路基因遗传变异与膝关节骨关节炎遗传易感性的关联研究MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞的增殖、生长、凋亡等过程中发挥着关键性作用。细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)为脯氨酸导向的丝/苏氨酸激酶,可以磷酸化与脯氨酸相邻的丝/苏氨酸。在丝裂原激活后,ERK接受上游的级联反应信号,转位进入细胞核,产生下游级联反应,从而参与细胞增殖与分化的调控。哺乳类动物细胞中,与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径。本文尝试探讨丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(MAPK/ERK)通路基因遗传变异与中国汉族人群KOA发病风险的相关性。采用病例对照研究设计,纳入278例膝关节骨性关节炎和年龄、性别匹配的289例健康对照,应用Regulome DB数据库筛选MAPK/ERK通路4个基因(MEK1/2和ERK1/2)的潜在功能位点,而后使用Sequenom Mass ARRAY平台对得到的5个位点进行基因分型。随后使用单因素和多因素logistic回归模型分析遗传变异与骨性关节炎之间的关联及其强度。单因素分析结果显示,MEK2基因的多态性位点rs350911与KOA发病风险在隐性模型(TT vs.TC+CC)中具有统计学关联(OR=2.62,95%CI:1.70-4.02,P<0.01)。基于多因素模型调整年龄、性别、BMI等因素后,rs350911仍与KOA发病风险相关联(OR=2.72,95%CI:1.75-4.22,P<0.01)。分层分析显示MEK2的rs350911等位基因效应在男性,BMI<25组中显著关联(P<0.05),且在性别分层时异质性检验有统计学意义(P=0.01),提示该位点对KOA的作用存在性别差异,与性别存在基因环境交互作用。综上所述,MEK2rs350911与中国汉族人群膝关节骨性关节炎发病风险增加有关,有望为膝关节骨性关节炎的诊断和治疗提供新靶点。