牡蛎是一种双壳软体动物,营养价值很高,是我国四大养殖贝类之一,也是世界排名第一的养殖贝类。牡蛎肉中含有丰富的营养物质和活性成分,具有重要的食用价值和药用价值,因此牡蛎肉的加工利用发展方向十分广阔。牡蛎摄食过程是非选择性的,在摄取食物的过程中,存在于水体中的微生物会一起积累并富集到体内。随着生鲜即食牡蛎的普及,牡蛎产品的安全问题越来越受到人们的重视。然而,目前牡蛎的非热力杀菌技术存在弊端和缺陷而无法大规模实践应用。光动力灭菌技术在医学领域主要用于杀灭恶性肿瘤细胞和致病微生物,有研究报道,光动力灭菌技术对液态食品中的金黄色葡萄球菌有较好的灭活作用。迄今为止,光动力灭菌技术对贝类体内微生物的灭活作用尚未见报道。本文的主要目的是对生鲜牡蛎中大肠杆菌和诺如病毒进行检测,并进一步研究光动力非热力杀菌对生鲜牡蛎中大肠杆菌和诺如病毒的灭活作用,最后对光动力处理后牡蛎的食用安全性进行初步评价,为光动力非热力杀菌技术在贝类加工中的推广应用奠定基础。论文主要包括三部分内容：第一部分：对生鲜牡蛎中大肠杆菌和诺如病毒的检测。采用快速检测方法—3M测试片法对牡蛎中的大肠杆菌进行检测,并用斯皮尔曼等级相关系数分析大肠杆菌的检出水平与周平均气温变化的相关性。结果显示：大肠杆菌经3M测试片检测的阳性率为5%,检出率虽低,但是检出水平为700cfu/g,超过欧共体理事会的指令要求。斯皮尔曼等级相关性分析显示：青岛市周平均气温与牡蛎大肠菌群检出水平具有高度的正相关性(p=0.639,P=0.001)。与大肠杆菌检出水平亦有一定的正相关关系(p=0.317,P=0.131)。提示人们对牡蛎产品的贮藏运输及质量控制予以高度重视。采用荧光定量PCR方法检测了牡蛎中的GⅠ和GⅡ型诺如病毒。荧光定量PCR技术具有高度的灵敏性,导致其检测过程中极易出现假阳性。本实验室与比利时根特大学合作,建立了检测诺如病毒时排除Q-PCR假阳性的序列比对方法。本研究首先对48份生鲜牡蛎样品进行了Q-PCR检测,从20份GII型诺如病毒阳性的样品中随机抽取8份进行真假阳性的鉴定。实验结果显示,8份阳性样品中有2份为真阳性,4份为假阳性,剩下的2份不能判定是否为真阳性,推测可能是变异的诺如病毒株。因此,应用序列比对方法排除Q-PCR检测结果的真假阳性具有可行性,值得进一步推广。实验结果同时提示,在Q-PCR实验操作过程中应小心谨慎,注意分区操作,避免阳性样品的污染。第二部分：光动力非热力杀菌对生鲜牡蛎中大肠杆菌和诺如病毒的灭活作用研究。首先采用姜黄素介导的光动力非热力杀菌技术分别对培养的DH5a和富集于生鲜牡蛎肠道中的DH5a进行灭活,进一步采用膜蛋白的提取及SDS-PAGE电泳、细菌膜通透性检测、核酸的提取及电泳等方法对光动力处理前后DH5a膜蛋白的变化、膜通透性的变化及核酸的完整性进行检测。结果显示：光动力处理后培养的DH5a的存活能力降低2-3Log(CFU/mL),对富集于生鲜牡蛎肠道中的DH5a的存活能力降低1-2Log(CFU/mL)。光动力非热力杀菌灭活大肠杆菌的机理可能为：首先破坏膜蛋白的高级结构使膜通透性增加,致使菌体内的无机盐等物质泄露,进而对细胞内的核酸进行破坏,引起细菌的死亡。采用姜黄素介导的光动力非热力杀菌技术分别对培养的MNV-1和富集于牡蛎肠道中的MNV-1进行灭活,采用透射电镜、RT-PCR、酶处理-RT-PCR对光动力处理前后牡蛎中MNV-1的超微结构、RNA完整性及蛋白外壳保护能力进行了检测。结果显示：光动力处理后培养的MNV-1的病毒滴度降低2-3Log(PFU/mL),对富集于牡蛎肠道中的MNV-1的病毒滴度降低1-2Log(PFU/mL)。光动力非热力杀菌灭活MNV-1的机理可能为：破坏病毒的超微结构,使病毒形成碎片；能够破坏RNA的完整性；使蛋白外壳对壳内RNA的保护能力降低。第三部分：光动力非热力杀菌处理牡蛎的食用安全性初步评价。采用细胞形态观察、MTT实验、细胞凋亡实验等方法,初步评价了姜黄素溶液及富集含姜黄素的生鲜牡蛎经光动力处理之后分别对L929细胞的形态、毒性及凋亡的影响。结果显示,姜黄素溶液及富集含姜黄素的生鲜牡蛎经光动力处理均不会影响细胞的形态变化,毒性等级为“0”或“1”,即没有细胞毒性；不会引起细胞凋亡。初步从细胞毒理学层面上证实了光动力处理牡蛎的食用安全性,尚有待于进一步验证。该结果将为姜黄素介导的光动力非热力杀菌技术在牡蛎中致病微生物灭活的推广应用提供理论依据。综上所述,大肠杆菌的检出水平与周平均气温的变化存在正相关关系；序列比对法排除诺如病毒的假阳性结果是值得推广的方法：姜黄素介导的光动力非热力杀菌技术对生鲜牡蛎体内的大肠杆菌和诺如病毒均可以在1min内达到良好的灭活效果,其中以10μM姜黄素的处理浓度最佳；且从细胞毒理学层面上初步评价了光动力非热力杀菌处理之后的牡蛎对细胞没有毒性。通过优化光源和光敏剂,可以达到更好的生鲜牡蛎的在体灭菌效果,这是光动力非热力杀菌与其它微生物灭活技术相比最大的优势。