【摘 要】
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杨树在我国分布广泛,生长较快,适应性强,繁殖容易,并且其基因组小,在传统和分子操作上要比大多数树种简单,是林木育种研究的模式树种。DREB1C转录因子(Dehydration Responsiv
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杨树在我国分布广泛,生长较快,适应性强,繁殖容易,并且其基因组小,在传统和分子操作上要比大多数树种简单,是林木育种研究的模式树种。DREB1C转录因子(Dehydration Responsive Element Binding)是一类与逆境胁迫相关的转录因子,它能够识别与干旱、高盐及低温等胁迫应答相关基因启动子区域中的DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件并与之结合,从而启动下游抗逆基因的表达,提高植物的抗逆性。开展杨树抗干旱耐盐碱转DREB1C基因研究对于我国干旱、盐碱地区的造林绿化、扩大杨树的栽培区、改善生态环境等方面均具有重要的现实意义。本研究以南林895杨(美洲黑杨I-69×欧美杨I-45杂种F1中选育出的优良无性系)为受体材料,采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化抗逆转录因子DREB1C基因;同时,同源克隆拟南芥逆境胁迫诱导性启动子rd29A,构建植物表达载体pDR2-rd29A并转化杨树,主要试验结果如下:1.根据NCBI上报道的rd29A启动子序列设计引物,从拟南芥中同源克隆rd29A启动子,构建植物表达载体pBrd,并转化烟草进行活性验证。转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温、干旱及高盐等胁迫诱导下,rd29A启动子可增强GUS基因表达,表明rd29A启动子可应用于植物抗逆基因工程研究。2.构建由逆境胁迫诱导型启动子rd29A启动目的基因DREB1C表达的植物表达载体pDR2-rd29A,双酶切鉴定结果表明,rd29A启动子成功地插入载体pDR2中;采用液氮冻融法将载体pDR2-rd29A导入农杆菌LB4404中,菌液PCR扩增出目的条带,证明该植物表达载体pDR2-rd29A已转入农杆菌LB4404中。3.进行选择性抗生素潮霉素的敏感性试验,分别对叶片分化及生根本底浓度进行敏感性试验,结果表明,3mg/L潮霉素(Hyg)可作为芽再生的临界筛选浓度;1.5mg/L Hyg可作为芽生根的筛选浓度。4.用农杆菌介导法将由两种启动子(组成型启动子35S和逆境胁迫诱导型启动子rd29A)启动的目的基因DREB1C导入南林895杨中。经过潮霉素筛选,得到潮霉素抗性的转35S::DREB1C基因的杨树80株,转rd29A::DREB1C基因的杨树40株。抗性植株的PCR与实时定量PCR分子检测结果,转35S::DREB1C基因杨树有30株呈阳性,转rd29A::DREB1C基因杨树有15株呈阳性,初步证明外源目的基因DREB1C已经整合到南林895杨基因组中。5.对转基因杨树植株的形态学观察表明,两类转基因植株形态正常,没有发生畸形突变,即没有引起植株的矮化现象。在干旱和高盐胁迫下,两类转基因植株均能正常生长,其生长势优于未转基因植株。这表明两类转基因植株的抗旱耐盐能力均强于对照植株。
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