偏肿革裥菌木质素降解酶的诱导及漆酶酶学性质研究

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ai2009ni
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为大幅度提高白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)的木质素降解酶的活性,本文对L.gibbosa的漆酶和Mnp活性分别进行了诱导研究,在此基础上对漆酶进行了分离纯化并检测其酶学性质。考虑到漆酶的实践应用,本实验对L.gibbosa的漆酶进行了固定化与脱色研究。最后对L.gibbosa中与木质素过氧化物酶基因表达调控有关的转录因子ace1基因进行克隆了与分析。诱导研究表明在白腐菌L.gibbosa产漆酶和Mnp的过程中,加入合适的诱导剂能大大提高酶的产量。当添加1.5%的麦麸(生物诱导剂)时对漆酶和MnP的诱导效果均较好;愈创木酚(化学诱导剂)对漆酶的诱导效果最好,而对于MnP,其最适的化学诱导剂为藜芦醇。组合诱导剂研究表明,同时添加最适生物诱导剂和化学诱导剂组合,均比单独使用一种诱导剂的效果更好。即同时添加1.5%麦麸与1 mmol·L-1愈创木酚的条件下,漆酶活性高达3594.46 U.L-1,是初始培养条件酶活的24.9倍。同时添加1.5%的麦麸和3 mmol·L-1的藜芦醇时MnP酶活(935.48 U·L-1)可提高12.2倍。漆酶纯化采用离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析,与粗酶液相比,纯化后的漆酶溶液比活力达到527.28 U.mg-1,提高约29倍,回收率为15.93%。通过SDS-PAGE蛋白电泳检测显示为单一的电泳条带,可知得到纯度较高的L.gibbosa漆酶蛋白,其相对分子量为66.7kDa,漆酶性质研究表明其最适反应温度为55℃,最适反应pH为2.5,在pH=7,4~20℃的环境中保存较稳定。固定化结果表明两种方法(海藻酸钠包埋和明胶吸附)均能很好的固定L.gibbosa漆酶,海藻酸钠包埋法固定化漆酶效果最好,固定漆酶活性为784.16U·g-1,保持率为80.2%。两种固定化漆酶的最适反应温度均为60℃,其热稳定性、pH和贮存稳定性也均优于游离漆酶,固定化漆酶对染料的降解效果也普遍较好。通过简并PCR和染色体步移技术克隆得到一条2956bp的全长基因片段,经比对分析后确定为L.gibbosa ace1转录因子基因。
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