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Micro RNA是乳腺上皮细胞乳脂代谢的重要调控因子。miRNA属于非编码RNA家族,约22个核苷酸左右。并通过与m RNA的3’未翻译区域（3’UTR）结合来调节其靶基因的表达。先前有研究报道,乳腺中miRNA的表达能够影响了乳腺发育进程、脂肪代谢和泌乳等相关功能。体外培养的牛乳腺上皮细胞（BMECs）因其泌乳的能力而被广泛用作研究牛奶生产及其乳成分的实验细胞模型。虽然不同miRNA在BMECs中乳脂合成中的作用已经被证实,但迄今为止,miRNA在乳脂合成中的大部分功能尚不清楚。而乳制品行业将利用新的分子标记和调控因子来进一步提高动物的乳品质性状来生产更加优质的牛奶。本课题组前期建立了中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞系。同时也对高乳脂和低乳脂中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞系进行了转录组学分析,筛选鉴定出了一批可能与乳脂代谢相关的差异表达miRNA,而miR-148a就是其中一员。本研究中,我们以bta-miR-148a作为研究对象来探究其对乳脂合成中的作用,以期为进一步提升乳品质性状应用于未来奶牛的分子育种奠定基础。本研究主要分为以下四部分:Bta-miR-148a在BMEC脂肪合成中的作用本课题组前期研究结果表明,高乳脂中国荷斯坦牛BMECs的bta-miR-148a表达量显著高于低乳脂中国荷斯坦牛。用bta-miR-148a mimic,inhibitor和sh NC转染BMECs 24小时后,在荧光显微镜下观察BMECs的形态和转染效率。显微镜下观察发现,奶牛乳腺上皮细胞形态未有明显改变,GFP的表达也验证了细胞转染的成功。使用荧光定量PCR技术检测转染bta-miR-148a mimic,inhibitor和sh NC组的BMECs中bta-miR-148a的相对表达水平。bta-miR-148a-mimic转染的BMEC中bta-miR-148a的相对m RNA表达显著高于sh NC转染的BMECs（P＜0.001）。然而,与sh NC组相比,bta-miR-148a-inhibitor转染的BMECs的相对表达显著降低（P＜0.001）。相对而言,bta-miR-148a在脂肪合成中的作用主要是通过检测细胞内TG和CHOL含量来确定的。结果表明:转染bta-miR-148a-mimic的BMECs中TG和CHO的含量显著低于sh NC组。此外,与sh NC组相比,转染bta-miR-148a-inhibitor的BMECs中TG和CHO的含量显著增加。因此,我们的结果表明,bta-miR-148a对BMECs中的TG和CHO含量具有负调节作用。Bta-miR-148a的靶基因鉴定本研究旨在验证中国荷斯坦牛中参与BMECs乳脂合成的bta-miR-148a的靶基因。利用q PCR和WB技术对转染bta-miR-148a mimic、inhibitor和miR-sh NC的BMECs中KLF6基因的表达量进行检测。通过生物信息学分析发现KLF6基因的3’UTR中存在btamiR-148a的结合位点,并通过双荧光素酶报告系统进行验证。q PCR和WB结果表明,与miR-sh NC相比,bta-miR-148a-mimic中KLF6基因的表达量显著降低,而bta-miR-148ainhibitor组KLF6基因的表达量显著上调。双荧光素酶报告系统的结果表明,为了评估荧光素酶报告载体活性,将pmiR-RB-REPORTTM-KLF6-3’-UTR-野生型和pmiR-RBREPORTTM-KLF6-3’-UTR-突变型与bta-miR-148a-mimic共同转染到BMEC中。结果表明,与KLF6突变型+bta-miR-148a-mimic组相比,KLF6野生型+bta-miR-148a-mimic组的相对荧光素酶活性显著降低（P＜0.001）。而与KLF6野生型+bta-miR-148a-mimic相比,KLF6-突变型+bta-miR-148a-mimic组的荧光素酶活性显著增加（P＜0.001）。生物信息学分析和荧光素酶活性显示bta-miR-148a直接靶向KLF6 m RNA的3’-UTR序列。3’-UTR区结合位点处的碱基突变会引发脱靶效应。因此,生物信息学分析、q PCR、western blot和荧光素酶报告分析的结果证实KLF6是bta-miR-148a的靶基因。KLF6对BMECs脂肪合成中的作用通过构建KLF6基因的过表达和沉默载体,以阐明KLF6基因在BMECs对乳脂合成的影响。分别用p BI-CMV3-KLF6和pb7sk-KLF6-sh RNA1载体转染BMECs来实现KLF6的过表达和干扰。结果表明,在转染pb7sk-KLF6-sh RNA的BMECs中,KLF6 m RNA和蛋白水平表达量显著降低。用p BI-CMV3-KLF6转染BMECs时获得了相反的结果,与对照组相比,过表达KLF6基因后其m RNA和蛋白水平的表达量显著上调。进一步的研究表明,在BMECs中转染p BI-CMV3-KLF6载体过表达KLF6基因发现其与TG和CHO呈正相关关系。与对照组相比,过表达KLF6基因后,BMECs内的TG和CHO显著增加。在反向验证实验中,通过在BMECs中转染pb7sk-KLF6-sh RNA,KLF6的表达量显著降低。且与对照组相比,干扰KLF6基因后,细胞内TG和CHO显著降低。因此,研究结果表明KLF6基因是一个在BMECs脂肪合成过程中起关键作用的新基因。KLF6也可作为分子育种中的标记辅助选择及提高奶牛乳品质性状的潜在候选基因。KLF6基因在脂肪合成中的相关通路的验证本研究旨在解析KLF6基因参与调节中国荷斯坦牛BMECs中乳脂合成的相关通路。KLF6的作用通路主要是基于先前的研究背景和KEGG数据库确定。选择两种类型的BMECs作为实验对象,一种是正常BMECs,另一种是敲除KLF6的BMECs。通过q PCR和western blot技术检测PPARA、PPARG和其他脂肪合成标记基因的表达水平。KLF6-KO-BMECs的相对m RNA和蛋白表达水平发现,与正常BMECs相比,KLF6-KO-BMECs的AMPK显著上调（P＜0.01）,KLF6-KO-BMECs中m TOR和PPARG表达水平下调（P＜0.01）。结果表明KLF6通过AMPK/m TOR靶向调控PPARG通路,从而在BMECs乳脂合成中发挥重要的调控作用。另一方面,q PCR和western blot结果显示,与正常BMECs相比,KLF6-KO-BMECs中所有与脂肪生成和胆固醇代谢相关的PPARA通路相关基因都显著下调。而脂肪合成标记基因的定量结果表明,与正常BMECs相比,KLF6-KO-BMECs中OXSM、FASN、MCAT、ABCG1和GPAM的表达显著上调。而CBP4、HSD17B8、ACACA、ACACB和AGPA的表达显著下调。String分析也进一步证明基因间的相互作用,进一步揭示这些基因在调节脂肪合成方面互作关系。上述实验的综合结果为建立bta-miR-148a负调控BMECs中TG和CHO积累的概念提供了证据。此外,研究结果还表明,KLF6的表达与BMECs中TG和CHO的含量直接相关。通路分析进一步揭示,bta-miR-148a通过靶向KLF6参与调控PPARG、PPARA通路和其他脂肪标记基因的表达,以调节BMECs中的脂肪合成。因此,通过靶向KLF6的bta-miR-148a是分子育种中的标记辅助选择增加奶牛产量和生产高价值牛奶成分的潜在候选基因。