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背景与目的微囊藻毒素-LR(Micr℃ystin--LR,MC-LR)是蓝藻产生的一种毒性最强的环状7肽分子,可造成严重的动物和人类肝、肾和生殖等多器官损害,危害人类健康。MC-LR通过膜转运受体OATP进入细胞,与蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)发生共价结合并抑制其活性,引起细胞内磷酸化水平增加和ROS产生,导致细胞骨架和DNA损伤、内质网压力、线粒体功能障碍和细胞凋亡。另外,MC-LR可激活NF-κB诱导细胞表达iNOS,并合成NO诱导胰腺细胞凋亡。NO通过蛋白质巯基亚硝基化(SNO)修饰调节细胞功能,是重要的凋亡调控因子。近来研究显示,亚硝化修饰糖酵解关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶(SNO-GAPDH),促进GAPDH与Siah1的结合,启动了细胞核内的凋亡程序,(SNO-GAPDH-Siah1)是NO特有的细胞凋亡机制。MC-LR诱导细胞产生NO,但其与MC-LR诱导的细胞毒性的相互关系还不明确。本研究通过分析MC-LR诱导NO以及SNO-GAPDH,阐明NO在MC-LR的毒性作用机制,探讨NO/SNO-GAPDH-Siah1机制在结肠癌细胞的治疗意义。另外,NO通过亚硝化修饰,调控肿瘤细胞糖酵解酶功能。而且,MC-LR可直接与糖代谢的酶结合,影响细胞代谢。因此,我们利用13C全标记的葡萄糖示踪细胞糖代谢物质,结合气相色谱-质谱(GC-MS)技术,检测MC-LR对体外培养的结肠癌细胞SW480糖代谢的影响,探讨MC-LR诱导的细胞凋亡与其代谢调控之间的联系。实验方法1.采用MTT方法,检测MC-LR对人结直肠癌细胞SW480、CaCo2、小鼠结肠癌细胞CT26、肝癌细胞HepG2、肝正常细胞LO2的细胞增殖的影响;利用Annexin-VFITC/PI双染法结合流式细胞术检测MC-LR诱导的细胞凋亡比率变化;2.利用NO2-/NO3-荧光检测法,检测细胞培养基中NO2-/NO3-浓度,探究MC-LR和NOS抑制剂(L-NAME、N-PLA、1400W)对细胞NO产生的影响;应用生物素转化(biotin-switch)和免疫印迹方法(westernblot),检测MC-LR对细胞内蛋白质亚硝化水平的改变。3.通过细胞核浆蛋白分离技术和免疫荧光等方法,检测MC-LR诱导细胞蛋白质核转移;4.流式细胞术检测siRNA-siah1或siRNA-GAPDH、以及NOS抑制剂(L-NAME)对MC-LR诱导的细胞凋亡比率的改变。5.13C-葡萄糖示踪结合气相色谱-质谱(GC-MS)技术,分析MC-LR对结肠癌细胞SW480糖代谢的影响。实验结果1.MTT检测显示,低剂量MC-LR(≤1uM)促进细胞增殖,而高剂量MC-LR(≥1 uM)诱导细胞凋亡呈浓度依赖性。其中,五株细胞株SW480、CaCo2、HepG2、L02和CT26对MC-LR毒性的敏感性不同,SW480和CT26较为敏感,而CaCo2、HepG2和L02的细胞活性在MC-LR10uM时,未见明显异常。流式细胞术显示,MC-LR毒性主要以诱导细胞凋亡为主要形式;Western blot显示MC-LR增加SW480细胞凋亡相关蛋白Bax表达,而降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达。2.Western blot 实验显示,MC-LR 诱导 SW480 中 NOS1 和 NOS2 表达;NO2-/NO3-荧光法发现MC-LR增加细胞内源性NO的产生,且MC-LR诱导的NO可被NOS1和NOS2的特异性抑制剂(N-PLA和1400W)抑制,证明MC-LR诱导细胞内NOS1和NOS2合成NO,提示NOS2可能在MC-LR诱导的NO合成中起主要作用。3.Biotin-switch 结合 western blot 结果显示,MC-LR 增加 GAPDH 的亚硝化水平,并且NOS的抑制剂NOS1和NOS2的特异性抑制剂N-PLA和1400W都能降低能够抑制GAPDH亚硝化。核蛋白Western blot和免疫荧光结果表明,MC-LR导致GAPDH核转移,NOSs抑制剂L-NAME能够抑制其核转移,提示MC-LR诱导GAPDH亚硝化,引发其核转移。4.利用siRNA干扰技术,下调Siah1或GAPDH转录后,或NOS抑制剂(L-NAME)下调NOSs的功能后,均能逆转MC-LR诱导的SW480凋亡,提示NO诱导的SNO-GAPDH-Siah1凋亡机制参与了 MC-LR诱导的细胞凋亡和细胞毒性作用。5.13C全标记的葡萄糖结合气相色谱-质谱技术显示,MC-LR处理后,细胞内丙酮酸和乳酸13C标记增加,TCA循环中间产物柠檬酸和天冬氨酸13C标记降低,说明MC-LR处理后抑制了 TCA循环,这可能与其诱导的线粒体损伤有关。结论:1.与文献报道一致,MC-LR对人和鼠的多种细胞具有复杂的生物学作用,低剂量MC-LR促进细胞增殖,高剂量诱导细胞凋亡。2.MC-LR刺激合成NO诱导GAPDH亚硝化,并通过SNO-GAPDH-Siah1机制诱导细胞凋亡。SNO-GAPDH-Siah1机制尚未在MC-LR的肿瘤毒性机制中报道,我们的研究为MC-LR在肿瘤治疗中的应用提供理论依据。3.MC-LR增加肿瘤细胞糖酵解,抑制TCA循环。MC-LR导致糖酵解增强的原因可能与其诱导的线粒体损伤,抑制细胞氧化磷酸化,导致糖酵解增加有关。