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实验目的:心血管疾病是全球死亡和发病的主要因素,几乎所有的心血管疾病都伴随着心脏重塑-心脏纤维化的发生。心脏纤维化主要是成纤维细胞增殖并活化为肌成纤维细胞,导致细胞外基质蛋白在心脏间质中过多积累,进而引起心脏收缩和舒张功能发生障碍。在心脏纤维化发生发展进程中,巨噬细胞扮演着举足轻重的角色,其分泌的细胞因子能直接或间接影响心脏重塑的的发展。细胞分裂周期蛋白42（Cdc42）是Rho GTPase家族成员,主要参与细胞生长发育、细胞迁移以及细胞骨架调节等各种生命活动过程,但Cdc42对心脏重塑时巨噬细胞功能的影响尚不清楚。我们的前期工作表明,巨噬细胞特异性敲除Cdc42明显加重异丙肾上腺素（Isoproterenol,ISO）诱导的心脏纤维化。本课题旨在探讨Cdc42缺失对巨噬细胞功能的影响及其在心脏重塑中的作用和机制。实验方法:1.利用Cdc42flox/flox小鼠与Lyz2-Cre（髓系细胞特异性表达Cre重组酶）小鼠杂交,最后得到髓系巨噬细胞特异性敲除Cdc42（FF+）小鼠和未敲除Cdc42（FF-）小鼠。2.选取状态良好且年龄相近（8-12周龄）的小鼠,随机分为对照组和实验组小鼠。实验组采用皮下注射ISO（20mg/kg/day,100μL/10g）,连续14天构建心脏重塑模型;对照组注射等量的生理盐水。3.通过划痕实验（Wound-healing）检测Cdc42介导巨噬细胞迁移的影响。提取小鼠腹腔巨噬细胞,利用ISO（10n M）以及ISO（10n M）刺激的H9C2细胞上清分别刺激腹腔巨噬细胞,观察划痕面积的变化。4.检测NLRP3通路相关蛋白。提取造模后小鼠心脏组织蛋白,通过Western Blot检测NLRP3、ASC、caspase1、cleaved-caspsae1、IL1β、cleaved-IL1β的蛋白表达水平。5.检测心肌细胞凋亡的情况。提取造模后小鼠心脏组织蛋白,Western Blot检测Bcl-2、Bax的蛋白表达水平;提取腹腔巨噬细胞,ISO诱导腹腔巨噬细胞的上清刺激大鼠心肌细胞（H9C2）,Western Blot检测心肌细胞凋亡相关基因表达情况。6.通过细胞吞噬实验检测缺失Cdc42对巨噬细胞的吞噬能力的影响。通过对小鼠（FF-和FF+）腹腔注射3%巯基乙酸盐培养基,第3天腹腔注射0.1%鸡红细胞,45分钟后,收集其腹腔积液,通过吉姆萨染色观察巨噬细胞吞噬情况。7.检测Cdc42对炎性因子的合成与分泌情况。提取腹腔巨噬细胞,利用ISO诱导腹腔巨噬细胞,收集其上清刺激H9C2,通过Western Blot和ELISA检测腹腔巨噬细胞和H9C2及其上清炎性因子的合成与分泌情况;利用ISO诱导H9C2,收集其上清刺激腹腔巨噬细胞,通过Western Blot和ELISA检测腹腔巨噬细胞和H9C2及其上清炎性因子的合成与分泌情况。8.检测成纤维细胞的活化情况。提取腹腔巨噬细胞,利用ISO诱导H9C2的上清刺激腹腔巨噬细胞以及ISO诱导腹腔巨噬细胞的上清刺激H9C2,收集上述细胞培养基上清分别刺激原代成纤维细胞,通过Western Blot检测成纤维细胞中纤维化相关基因（Collagen III、α-SMA、vimentin）的表达情况。实验结果:1.巨噬细胞缺失Cdc42显著加重ISO诱导心脏重塑后的细胞焦亡和凋亡;2.巨噬细胞缺失Cdc42显著增加ISO诱导心肌细胞的凋亡;3.巨噬细胞缺失Cdc42显著增加ISO诱导心脏组织中IL-10,IL1β的含量,并减少IL-6的含量;4.Cdc42缺失显著增加ISO诱导巨噬细胞中IL1β,IL-10的合成与分泌;5.巨噬细胞缺失Cdc42显著抑制巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力。6.Cdc42缺失增加巨噬细胞受ISO刺激心肌细胞后的分泌物介导的迁移能力和促进成纤维细胞活化作用;结论:在ISO诱导心脏重塑时,Cdc42缺失促进单核/巨噬细胞的浸润,并可能通过减弱其吞噬作用,促进IL10,IL1β的合成与分泌,增加心脏组织的炎症损伤,加重心脏纤维化。缺失Cdc42可能通过调节巨噬细胞中IL-10、IL-6、TNF-α等炎性因子的合成与分泌,促进心肌细胞凋亡和成纤维细胞的活化,增加胶原蛋白的合成,进而加重心脏纤维化。