在长期自然演化过程中,昆虫对多变的环境具备高度的适应能力与其变态发育密切不可分。昆虫的变态类型多种多样,但无一例外都经历着旧器官的消亡和新器官的重建。卵巢作为雌性生殖系统的重要组成,在昆虫幼虫-蛹的转变过程中发生变态发育,其外膜退化,卵巢管快速生长,确保卵巢内卵子的正常发育及成熟。此外,部分器官也会在昆虫每个龄期的更替过程中发生更新发育,如:气管在每次眠起后随蜕皮过程去除原有的结构,形成更庞大的气体交换网络,来适应伴随个体生长而增加的氧量需求。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）是一类锌依赖性内肽酶,主要功能是降解细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）,对组织器官发育过程中的ECM降解平衡具有十分重要的作用。因此,探究MMPs在昆虫器官发育过程中的功能及机制,对丰富和完善昆虫变态发育机制具有重要的意义。同时,昆虫器官变态发育机制的解析对于有害昆虫的新型生物防治策略具有重要的参考价值。家蚕（Bombyx mori）作为鳞翅目的重要模式,其一生经历卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段,属于完全变态昆虫。前期研究表明,在家蚕中敲除MMPs家族成员,会导致家蚕发育异常,如幼虫气管分支发育异常、成虫交配及产卵过程异常等,暗示MMPs在家蚕的变态发育过程中行使重要功能。本研究基于Bm MMPs基因缺失品系所呈现的差异表型,对Bm MMPs家族成员在家蚕器官发育中的作用进行分析,确定了Bm MMP1基因对家蚕气管发育具有重要作用,探究了BmMMPs基因调控家蚕卵巢发育的机制,可望为家蚕卵巢发育的调控机制提供新的线索,并为解析昆虫卵巢的发育机制提供理论参考。论文获得的主要研究结果和结论如下:1.Bm MMP1基因参与家蚕气管发育前期研究发现Bm MMP1-KO转基因家蚕品系在五龄第三天开始大量死亡以至于无法完成世代,解剖发现其气管发育异常。本研究通过实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）实验对Bm MMP1基因在家蚕气管发育过程中的表达情况进行分析,发现Bm MMP1基因在气管更新发育时上调表达。为进一步分析Bm MMP1基因对气管发生及发育的影响,首先通过家蚕胚胎离体培养及实时显微观测技术对胚胎期Bm MMP1-KO品系的气管发生过程进行实时观察,发现Bm MMP1基因的缺失不影响气管在胚胎期的发生;随后对一龄期至五龄期家蚕幼虫的气管发育过程进行连续观察,发现敲除Bm MMP1基因后家蚕气管分支数在三龄期开始显著减少;进一步利用显微测量、组织免疫荧光及5’-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2’-deoxyuridine,Brd U）标记技术对气管螺旋丝间距、气管细胞间距及增殖能力进行检测分析,发现敲除Bm MMP1基因导致气管螺旋丝间距不能随个体发育而增加,气管细胞排列拥挤、细胞间隙减小且增殖能力显著减弱。以上结果表明Bm MMP1基因对于家蚕气管发育及气管细胞生长必不可少。2.BmMMP2基因调控家蚕卵巢发育前期研究发现BmMMPs-KO品系及BmMMP3-KO品系在幼虫期的生长较为正常,经历蛹期变态后可正常上蔟化蛾,但在成虫期出现交配和产卵困难的现象,推测其生殖系统发育受到影响。通过解剖观察发现,相比于Bm MMP3-KO品系,BmMMPs-KO品系的雌性生殖系统表型差异更为显著,尤其是卵巢管及卵子。为深入研究家蚕卵巢管和卵子在卵巢中的发生发育情况,对BmMMPs-KO品系的卵巢在变态期的发育情况进行解剖分析,发现敲除BmMMPs基因导致卵巢膜的降解及卵巢管的发育受阻,两侧卵巢均无法变态发育形成四根独立的卵巢管,而是包裹缠绕在一起且极易破碎,完全失去了原本的弹性和韧性。随后通过透射电镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察,发现敲除BmMMPs基因后卵巢管上皮细胞减少,边缘不清晰;同时,5’-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U）标记结果显示卵巢管上皮细胞的增殖能力显著减弱并发生凋亡现象。进一步,利用冷冻切片-组织染色实验对BmMMPs-KO品系的卵巢发生变态前发育情况进行分析,结果显示预蛹期前卵巢发育情况与对照相比无明显差异。以上结果表明BmMMPs基因的缺失阻碍家蚕卵巢在变态期的发育。为了进一步确定BmMMP2基因对家蚕卵巢发育过程的调控作用,我们构建了BmMMPs融合红色荧光蛋白Ds Red标签的过表达转基因品系,并在不影响插入位点处基因表达的情况下成功检测到了BmMMPs基因的过表达。本研究利用该过表达转基因品系对BmMMPs蛋白在家蚕雌蛾的生殖系统及卵巢中的原位表达进行检测,结果显示BmMMPs-Ds Red荧光主要定位在卵巢膜及卵巢管中。进一步通过qRT-PCR和Western Blotting（WB）对BmMMPs在雌性生殖系统中的表达进行定量分析,发现BmMMPs确实在以上两个时期的卵巢管中均有表达,在卵巢发生变态重塑时其在卵巢膜的表达量更高。此外,利用q RT-PCR分析了BmMMPs基因在家蚕卵巢从幼虫四龄期至成虫的整个发育过程中的时期表达特征,发现BmMMPs基因在吐丝期第二天及蛹期第八天高表达。以上结果表明BmMMPs基因通过参与卵巢膜的降解及卵巢管的发育来调控家蚕卵巢的发育。3.BmMMPs基因对家蚕卵子发育的影响卵子在卵巢中发生发育,卵巢管为卵子提供营养运输和形态支持。为了进一步探究BmMMPs基因对卵子发育的影响,本研究通过解剖观察、卵子数统计和扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）观察等方式对BmMMPs-KO品系的卵子发育情况进行分析,发现其卵子数量显著减少,且多数卵子发育不完全,但仍有少数卵子可发育至正常大小并具有正常卵的结构。通过对这部分大小近似正常的卵子进行孤雌生殖实验,发现其可以发育转色。进一步SDS-PAGE考马斯亮蓝染色及WB实验结果显示,其卵黄原蛋白（vitellogenin,Vg）的合成、转运及吸收过程也可正常进行。此外,BmMMPs基因在家蚕雌性生殖系统的表达特征显示其在卵子中的表达量较低。根据以上结果推测BmMMPs基因通过参与调控卵巢发育过程,控制卵巢膜的降解及卵巢管发育,影响为卵子发育提供所需的空间和营养物质,由此影响卵子的发育。4.BmMMPs通过降解Ⅰ型胶原调控家蚕卵巢发育为了探究BmMMPs基因调控家蚕卵巢发育的机制,本研究通过Label-free蛋白质组学分析了BmMMPs-KO品系及野生型Dazao品系的预蛹期卵巢蛋白表达情况。首先,对可被MMPs直接降解的细胞外基质相关蛋白的表达差异情况进行分析,筛选到差异最为显著的Collagen alpha-1（I）,其在敲除BmMMPs基因之后显著性上调表达。q RT-PCR定量分析发现Collagen alpha-1（I）基因在卵巢发育过程中的表达趋势与BmMMPs基因一致:在吐丝期第二天及蛹期第八天上调表达;在发生变态发育时的卵巢的不同部位的表达量与BmMMPs基因具有一致性:在卵巢膜高表达。同时,I型胶原原位酶谱实验结果显示,在野生型Dazao品系中,Ⅰ型胶原在卵巢管及卵巢膜的位置被降解,而BmMMPs-KO品系的卵巢中没有发生明显的降解现象。此外,成虫期卵巢管的免疫组化结果显示,野生型Dazao品系的卵巢管中的纤维细胞均匀饱满,胶原在细胞周围有序分布;而BmMMPs-KO品系卵巢管中纤维细胞显著减少且呈细长状,胶原呈现异常堆积现象。以上结果表明,敲除BmMMPs基因后家蚕卵巢膜及卵巢管中的胶原降解受阻,并且Ⅰ型胶原可作为BmMMPs的作用底物。5.Bm ILP与BmMMPs基因协同调控家蚕卵巢发育研究发现:心脏、肺等器官中的胶原累积会造成组织纤维化的发生,而为了避免其发生,胰岛素家族成员松弛素（Relaxin）将诱导MMPs对胶原进行降解。家蚕中类似胰岛素家族成员众多,通过本研究中的蛋白质组学差异蛋白筛选,发现差异最为显著的四个蛋白有:ATP合成酶（ATP synthase subunits）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase Aurora-2）、胰岛素类肽（insulin-like peptide）及一个未知蛋白,其中Insulin-like peptide（Bm ILP）为家蚕胰岛素家族成员。家蚕五龄幼虫组织表达谱显示,Bm ILP基因在卵巢中特异高表达。家蚕卵巢时期表达谱显示,Bm ILP基因随卵巢发生变态重塑过程逐渐上调表达,但敲除BmMMPs基因之后,其表达量在卵巢变态发育后显著下调。在成虫期生殖系统各组织中,Bm ILP与BmMMPs基因一样在卵巢管高表达。此外,干涉Bm ILP基因后家蚕卵巢管出现与BmMMPs-KO品系类似表型。为探究Bm ILP与BmMMPs基因的调控关系,本研究进行了体内外添加Bm ILP蛋白及在Bm NS细胞中进行基因过表达和干涉实验,结果显示Bm ILP基因调控BmMMPs基因的表达。由此,推测Bm ILP基因可能通过诱导BmMMPs基因上调对Collagen-I进行降解参与家蚕卵巢发育。为了寻找敲除BmMMPs基因后导致Bm ILP基因在家蚕卵巢中于变态期显著性下调的原因,结合蛋白组KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）显著富集于胰岛素相关信号通路的结果,通过WB实验检测其关键蛋白的表达情况,发现敲除BmMMPs基因导致家蚕卵巢中的AKT（Protein kinase B）磷酸化水平在其变态发育发生后逐渐上调。为了验证BmMMPs基因是否受到PI3K/AKT（phosphoinositide 3-kinase/AKT）信号的调控,利用该通路抑制剂LY294002进行个体注射及细胞添加实验,结果显示BmMMPs基因在卵巢组织及卵巢细胞系Bm NS中的表达均受到抑制。以上结果表明Bm ILP基因对家蚕卵巢发育至关重要,其可能通过PI3K/AKT信号通路对BmMMPs基因进行调控,敲除BmMMPs基因后导致AKT磷酸化水平异常,这可能是导致Bm ILP基因从卵巢发生变态发育之后持续性显著下调的原因。