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流胶病是由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引发的树干、树枝流出胶体物质的病害,可导致果实减产,甚至树木死亡。由于化学合成抗真菌剂防治效果有限,流胶病生物防治引起人们广泛关注。论文从蜂蜜中筛选了拮抗Botryosphaeria dothidea的细菌,探讨了其生理生化特征、分析了其16S r RNA和gyr B基因序列;研究了抗真菌物质的分离纯化、鉴定,抗菌机制;完成了全基因组测序分析。为提高脂肽产量、降低生产成本,论文对其进行液体深层发酵和固态发酵优化。主要结果如下:(1)从130株蜂蜜来源的细菌中,发现23株细菌对葡萄座腔菌具有拮抗作用,筛选出1株拮抗效果最好的菌株SYBC H47,经生理生化鉴定、16S r RNA和gyr B基因分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌,并命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYBC H47;其保藏号:CCTCC NO:M2013283。(2)B.amyloliquefaciens SYBC H47发酵上清液具有生物表面活性剂特性,可与正己烷、甲苯、正庚烷、柴油、橄榄油、煤油和机油7种碳氢化合物发生乳化反应,对机油具有驱油效果。酸性环境(pH 1-5)显著降低上清液抗菌活性和乳化活性;中性及碱性环境(pH 6-12)抗菌活性和乳化活性相对稳定。在30-100℃温度范围内,发酵液抗菌活性和乳化活性相对稳定。其抗菌谱表明菌悬液和发酵上清液对葡萄座腔菌(B.dothidea)、黑曲霉(Aspergillus niger)、毛霉(Mucor racemosus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、桔青霉(Penicillium citrinum)和白假丝酵母(Candida albicans)6种植物病原菌均具有抑菌效果,其中菌悬液的抑制率高于发酵上清液的抑制率。(3)探讨了B.amyloliquefaciens SYBC H47拮抗葡萄座腔菌的作用机制。菌体发酵液中有3种脂肽类物质,其中杆菌霉素L(bacillomycin)浓度为200μg·m L-1时,可完全抑制葡萄座腔菌孢子的萌发,而在相同浓度条件下,芬荠素(fengycin)和表面活性素(surfactin)对孢子萌发抑制率低于60%。芬荠素对菌丝体生长抑制效率约45%,比杆菌霉素L提高约5%,表面活性素的抑制效率有限,仅为10%左右。混合脂肽不论对孢子萌发和菌体生长均表现出最佳抑制效果,原因可能为脂肽之间存在抗菌叠加效应或协同效应。(4)B.amyloliquefaciens SYBC H47菌体也可产生儿茶酚型铁载体,其也能拮抗葡萄座腔菌,但B.amyloliquefaciens SYBC H47在产脂肽培养基中不产生铁载体。在MM9培养基中培养,其发酵产量为106μmol·L-1。对葡萄座腔菌的毒力回归方程为y=1.432x+0.578,EC50和EC90分别为0.395 g·L-1和3.099 g·L-1。(5)体外抗病实验结果表明脂肽菌悬液、脂肽溶液对流胶病的防治效果均为100%。田间实验结果表明脂肽菌悬液可使流胶病病害指数降到22.5%,显著优于多菌灵的防治效果。田间实验的防治效果低于体外抗病实验的原因在于雨水稀释了生物防治剂,导致防治效果降低。目前关于用解淀粉芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌生物防治流胶病的研究鲜有报道,本研究为流胶病的防治提供了新的思路。(6)通过全基因组重测序,拼接后获得长度为3884433 bp的全基因组序列,NCBI数据库的登录号为CP017747;获得杆菌霉素L、芬荠素、表面活性素和铁载体的合成基因簇序列。此外,菌体还包含聚酮类化合物合成基因簇。(7)优化脂肽生产培养基,分析选择性增加芬荠素和杆菌霉素L合成的关键因素。提高温度和氧传递系数有利表面活性素合成,而不利芬荠素和杆菌霉素L合成。优化后培养基(g·L-1):葡萄糖42.65,NH4NO3 6.19,MgSO4·7H2O 0.74,KH2PO4 2.72,FeSO4·7H2O 0.274,MnSO4·H2O 0.0017,pH 7.0。培养温度为27℃,装液量75 m L·250 m L-1(Rv=0.3),转速250 r·min-1。脂肽总量达到2.46 g·L-1,比优化前(1.44 g·L-1)提高70.83%,其中表面活性素、芬荠素和杆菌霉素L相应提高38.98%、106.77%和133.33%。(8)将优化后的摇瓶培养条件在5 L发酵罐上进行验证,采用泡沫收集法研究脂肽在泡沫中的含量。结果发现通气量为0.6 vvm、搅拌速率为150 r·min-1时,脂肽产量达到2.91 g·L-1,芬荠素和杆菌霉素L含量分别为25.6%和44.2%。8 h添加Mg2+和Fe2+离子使脂肽产量达到3.40 g·L-1,芬荠素和杆菌霉素L的含量为27.4%和42.3%。而添加消泡剂后,脂肽产量为1.63 g·L-1,仅比Landy培养基摇瓶发酵提高13.19%,但不会改变芬荠素和杆菌霉素L的含量。以上结果表明,通过调控搅拌速率、装液量及通气量进行限制性供氧,可选择性增强芬荠素和杆菌霉素L的合成;添加Mg2+和Fe2+离子可有效缓解因脂肽对这两种离子的螯合而导致的发酵液中金属离子的缺乏,使细胞获得足够的金属离子用于细胞生长代谢。(9)通过对固态发酵多个发酵参数进行单因素实验,发现豆油、含水量、接种量和温度四个参数对脂肽产量影响显著。通过Box-Behnken设计分析实验获得最佳组合为:黄豆饼粉5 g,水稻秸秆5 g,豆油0.336 g,葡萄糖0.3 g,Ca CO3 0.4 mg,含水量为58.53%,接种量为15.29%,pH 7,温度30℃,培养时间96 h。此时脂肽产量可达10.87 g·kgds-1,比优化前提高80.86%,为液体深层发酵脂肽产量的3.37倍。