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目的:结肠炎相关结肠癌(Colitis-associated cancer,CAC)是结直肠癌的一种亚型,与结肠炎(colitis)或炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases,IBD)密切相关。大量临床及基础研究资料都表明,炎症与肿瘤有着十分密切的关系,炎症对肿瘤的发生与发展起着十分重要的促进作用。结肠癌形成的一个重要高危因素是反复发作、迁延难愈的结肠慢性炎症。已有研究证实DNA甲基化的变化可出现在一些癌症的早期阶段。癌症的发生发展与异常的DNA甲基化有着密切的关系,细胞的恶变的逆转可能通过纠正DNA甲基化的异常状态来实现。研究表明结肠炎相关肿瘤的治疗靶点可与DNA甲基化的潜在应用有密切联系。本研究在此基础上,探讨DNA甲基化/去甲基化酶的变化与CAC发生发展的关系。本研究以AOM/DSS模型为实验体系,探讨DNA甲基化酶(DNMT3A、DNMT3B、DNMT1)和DNA去甲基化酶(TET1、TET3、TDG)在结肠炎-癌病理进程中的动态变化,分析CAC的发病机理,探索CAC与DNA甲基化之间的本质联系,为确立CAC的治则提供科学依据,并探索相关中药干预机制。内容:1.清热解毒“药对”对CAC模型小鼠结肠组织DNMT3AmRNA、TET3mRNA、TDGmRNA的影响方法:建立CAC小鼠模型,具体是采用一次性腹腔注射氧化偶氮甲烷(AOM)+三个循环自由饮用葡聚糖硫酸钠(DSS水)的方法建立,药物组给予对应药物灌胃,模型组给予等剂量纯水灌胃,分别在5周末和8周末取材。采用RT-PCR(real time PCR)的方法检测CAC模型小鼠不同时期结肠组织中DNMT3AmRNA、TET3mRNA、TDGmRNA的表达水平,并对结果进行统计学分析。结果:与正常对照组比较,5周时(病理表现为:炎症),模型组DNMT3AmRNA表达有下降趋势(P>0.05),TET3mRNA、TDGmRNA表达明显增高(P﹤0.05);与模型组相比,救必应+败酱草组(JB组)、柳氮磺吡啶(SASP组)DNMT3AmRNA表达增高,TET3mRNA、TDGmRNA表达明显降低(P﹤0.01或P﹤0.05)。与正常对照组比较,8周时(病理表现为:中重度异型增生和腺癌形成),模型组DNMT3AmRNA表达有上升趋势(P>0.05),TET3mRNA、TDGmRNA表达明显降低(P﹤0.05);与模型组相比,救必应+败酱草组(JB组)DNMT3AmRNA表达明显降低、TET3mRNA表达明显升高,柳氮磺吡啶(SASP组)TET3mRNA、TDGmRNA表达明显增高(P﹤0.01或P﹤0.05)。2.清热解毒“药对”对CAC模型小鼠结肠组织中DNMT3A、TET3、TDG蛋白表达的影响方法:创建CAC模型,具体是采取C57BL/J小鼠复制由氧化偶氮甲烷(AOM)结合葡聚糖硫酸钠(DSS水)的方法建立,救必应+败酱草和柳氮磺吡啶对CAC小鼠进行干预,采用Western blot方法检测小鼠不同病理阶段结肠组织DNMT3A、TET3、TDG蛋白的表达,并对其进行统计学分析。结果:与正常对照组比较,5周时模型组甲基化酶DNMT3A的表达明显下降,去甲基化酶TET3、TDG表达明显增高(P﹤0.01或P﹤0.05);与模型组相比,救必应+败酱草组(JB组)DNMT3A表达明显增高、TET3表达明显降低,柳氮磺吡啶(SASP组)DNMT3A表达明显增高,TET3、TDG表达明显降低(P﹤0.01或P﹤0.05)。与正常对照组比较,8周时模型组DNMT3A、TDG表达明显升高,TET3表达明显下降(P﹤0.01或P﹤0.05);与模型组相比,救必应+败酱草组(JB组)和柳氮磺吡啶(SASP组)DNMT3A表达明显降低、TET3表达明显升高(P﹤0.01或P﹤0.05)。3.清热解毒“药对”对CAC模型小鼠结肠组织切片中DNMT1、DNMT3B、TET1蛋白表达的影响方法:创建CAC模型,具体是采取C57BL/J小鼠复制由氧化偶氮甲烷(AOM)结合葡聚糖硫酸钠(DSS水)的方法建立,救必应+败酱草和柳氮磺吡啶对CAC小鼠进行干预,造模结束后取结肠组织洗净后用中性福尔马林固定,然后制作病理切片和进行免疫组化染色,使用Image Pro Plus软件进行半定量分析,进而计算出DNMT1、DNMT3B、TET1的平均光密度,并对其进行统计学分析。结果:与正常对照组相比,5周时模型组甲基化酶DNMT3B表达明显降低,去甲基化酶TET1表达明显增高,甲基化酶DNMT1表达也明显增高(P﹤0.01或P﹤0.05);与模型组比较,救必应+败酱草组(JB组)、氮磺吡啶(SASP组)DNMT1、TET1表达明显降低(P﹤0.01或P﹤0.05)。与正常对照组比较,8周时模型组DNMT1、DNMT3B表达明显上升(P﹤0.05);与模型组相比,救必应+败酱草组(JB组)DNMT1、DNMT3B表达明显降低,柳氮磺吡啶(SASP组)DNMT1表达明显降低(P﹤0.01或P﹤0.05)。结论:综合研究结果分析,结肠炎相关结肠癌(CAC)小鼠由炎症向癌变转化的过程可能与DNA甲基化酶DNMT3A、DNMT1、DNMT3B/DNA去甲基化酶TET1、TET3、TDG在不同病理阶段表达水平的动态变化有关,即DNA甲基化/DNA去甲基化的平衡状态有所变化,在炎症阶段,主要表现为甲基化酶降低而去甲基化酶增高;在肿瘤形成阶段,主要表现为甲基化酶增高而去甲基化酶降低。救必应+败酱草、柳氮磺吡啶均可在一定程度上扭转这种平衡的变化,从而影响结肠炎-癌病理发展过程。